撰文 | Qi

Menin作为一种进化保守的核因子，能与染色质结合以招募蛋白如MLL1和MLL2组蛋白甲基转移酶复合物、MLL1致癌融合蛋白和包含c-MYC在内的多种转录因子等。HOX基因的MLL1/MLL2依赖性H3K4三甲基化及其在发育过程中的长期稳定表达都需要Menin。研究发现，Menin可以在人类的特定疾病中发挥特定功能，比如在神经内分泌恶性肿瘤中充当肿瘤抑制因子，在肝细胞癌和MLL1重排（MLL1-r）白血病中充当致癌辅助因子【1】。考虑到Menin在恶性肿瘤中的促癌作用，针对Menin-MLL1和Menin-MLL2的小分子抑制剂已显示出巨大前景【2】，例如三种结构不同的抑制剂已经进入临床试验（NCT04065399、NCT04067336、NCT04811560）【3-5】。因此，了解这些药物的分子作用机制将有助于开发生物标志物来预测治疗反应和耐药性，并导致合理设计更有效的联合治疗。

近日，来自美国洛克菲勒大学的C. David Allis团队等多个团队在Cancer Discovery杂志上合作发表了一篇题为A molecular switch between mammalian MLL complexes dictates response to Menin-MLL inhibition的文章，他们发现了决定对Menin-MLL抑制剂反应的MLL1-Menin和MLL3/4-UTX染色质修饰复合物之间的保守分子开关。Menin-MLL1通过阻止MLL3/4-UTX复合物与靶基因启动子以促进白血病，破坏Menin-MLL1相互作用会触发肿瘤抑制程序的UTX依赖性转录激活，使用CDK4/6抑制剂缓解了对Menin抑制剂不敏感的白血病细胞的治疗抗性。总之，这些发现揭示了进化保守的表观遗传介质（如MLL1-Menin和MLL3/4-UTX）的新功能。

为了了解MLL1-r白血病对Menin的依赖性并确定决定对Menin-MLL抑制剂（MI-503）的反应和抗性的因素，作者进行了一系列基于CRISPR的基因筛选，通过评估培养期间sgRNA丰度的变化来计算文库中包含的每个基因的分数（图1）。作者观察到以组蛋白H3K27去甲基化酶Utx和H3K4单甲基转移酶Mll3和Mll4为靶点的sgRNAs在Menin-MLL抑制剂条件下中富集程度最为显著。此外，作者通过ChIP-seq发现MI-503处理后会导致UTX的启动子结合相对于基线水平显著增加，提示Menin-MLL1相互作用的破坏导致 UTX 动态募集到启动子区域。

图1. 基于CRISPR-Cas9的筛选策略识别Menin MLL抑制反应的调控因子。

由于Menin缺乏明确的DNA结合结构域，作者想知道序列特异性DNA结合因子是否可以调节MLL1-Menin和MLL3/4-UTX在特定启动子的占据之间的转换。作者通过对白血病细胞和成纤维细胞中Menin和UTX结合的基因组区域的基序分析显示，NF-Y序列基序在MLL-AF9细胞中富集最为显著，ChIP-Seq分析表明它共同占据了由Menin和UTX相互结合的位点。为了确定在MI-503的情况下NF-YA（NF-Y复合体的DNA结合和活化亚基）基因组结合的变化与Menin、UTX和MLL3/4染色质结合的变化如何相关，作者对ChIP-Seq数据集进行了相关性分析，发现在用MI-503处理的细胞中，NF-YA和Menin信号耗尽最显著的基因组位点也是高UTX和MLL3/4富集的区域。用MI-503处理NfyaKO细胞导致正常状态下Menin和NF-YA结合的基因组区域的UTX占有率显着增加。总之，这些结果暗示NF-Y作为标记Menin-UTX靶位点的序列特异性转录因子之一，并可能在介导这些基因座的Menin-UTX转换中发挥功能性作用。

为了深入了解由Menin-UTX开关调节的细胞和分子途径，作者对Menin-UTX靶标进行了GO分析，并发现了它们与增殖、分化和存活相关的转录程序相关，通过进一步对来自MI-503处理的UtxWT和UtxKO细胞的转录数据GSEA分析发现UTX的存在与细胞周期停滞和治疗诱导的衰老基因相关。衰老可以在转录和转录后水平进行调节，作者随之检查了Menin-UTX分子开关是否通过直接结合其启动子来直接调节细胞周期停滞和衰老相关基因的表达。在基础状态下，Menin与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK抑制子Cdkn2c/Ink4c和Cdkn2d/Ink4d的启动子结合，并且在Menin-MLL抑制后减少，相反，UTX仅在Menin-MLL抑制的情况下与这些启动子结合，导致两种CDK抑制剂的UTX依赖性上调。因此，Menin-UTX分子开关通过直接染色质调节来调节这些CDK抑制子的表达。此外，作者发现Menin-MLL和CDK4/6的联合抑制导致抑制细胞增殖的协同效应，能达到与MI-503处理UtxWT细胞所达到的水平相似的水平，这表明由Menin和UTX调节的靶向途径可以产生组合治疗效果，以及MI-503的抗白血病作用主要是通过肿瘤抑制途径的重新激活。

图2. Menin-UTX开关对肿瘤抑制途径的转录协同调控。

最后，为了验证上述Menin-UTX分子开关在接受Menin-MLL抑制剂治疗的白血病患者中是否有效，作者对两名使用SNDX-5613治疗的NPM1c突变（患者1）和MLL重排患者（患者2）的原发性AML细胞进行RNA-Seq分析，并检测了MLL重排患者来源的异种移植物对SNDX-5613类似物（VTP-50469）的体内反应和抗性。结果显示，移植了MLL3野生型PDX的小鼠显示出对VTP-50469的有效治疗反应和Menin-UTX靶标的转录诱导。相反，MLL3 突变体 PDX 表现出对VTP-50469的主要抗性，并且未能诱导该基因表达程序。为了研究CDK4/6抑制是否可以克服在Menin抑制剂耐药的情况下内源性CDK抑制子的缓慢诱导，作者用VTP-50469和Palbociclib（CDK4/6抑制剂）治疗了携带MLL3突变体AML PDX的小鼠，这种处理可以诱导效果显著的白血病消退，为联合 Menin和CDK4/6抑制剂的可行性和有效性提供了临床前证据。

总之，这项工作表明Menin-MLL1复合物在稳态条件下维持对一组靶基因的抑制，只有在Menin抑制剂介导的MLL1-Menin取代和MLL3/4-UTX募集时才会激活。此外，这里定义的一组Menin-UTX靶基因富含与细胞周期停滞和衰老相关的基因，它们的激活对于体外和体内对Menin-MLL抑制剂的反应至关重要。由于临床前数据表明这类药物具有强大的治疗急性白血病的能力，识别可以预测不完全反应的标志物以及早开始联合治疗的目标非常重要。哪些 MeninUTX 靶标可以作为具有足够敏感性和特异性的良好生物标志物，仍有待在更多临床试验中进行研究。

原文链接：

https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-22-0416

参考文献

1. Chandrasekharappa SC, Guru SC, Manickam P, Olufemi SE, Collins FS, Emmert-Buck MR, et al. Positional cloning of the gene for multiple endocrine neoplasia-type 1. Science. 1997;276:404–7.

2. Xu B, Li S-H, Zheng R, Gao S-B, Ding L-H, Yin Z-Y, et al. Menin promotes hepatocellular carcinogenesis and epigenetically up-regulates Yap1 transcription. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:17480–5.

3. Krivtsov AV, Evans K, Gadrey JY, Eschle BK, Hatton C, Uckelmann HJ, et al. A Menin-MLL Inhibitor Induces Specific Chromatin Changes and Eradicates Disease in Models of MLLRearranged Leukemia. Cancer Cell. 2019;36:660–73.e11.

4. Uckelmann HJ, Kim SM, Wong EM, Hatton C, Giovinazzo H, Gadrey JY, et al. Therapeutic targeting of preleukemia cells in a mouse model of NPM1 mutant acute myeloid leukemia. Science. 2020;367:586–90.

5. Kurmasheva RT, Bandyopadhyay A, Favours E, Pozo VD, Ghilu S, Phelps DA, et al. Evaluation of VTP-50469, a menin-MLL1 inhibitor, against Ewing sarcoma xenograft models by the pediatric preclinical testing consortium. Pediatr Blood Cancer. 2020;67:e28284.

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