导读
酒精性肝病(ALD)是由持续大量饮酒引起的。目前ALD的治疗策略是基于酒精戒断结合抗氧化剂干预，这是一个长期的过程，疗效差，患者依从性低。酒精诱导的CYP2E1上调是ALD的关键调节因子，但在人类中并不可行，而且还没有发现临床上相关的治疗ALD的方法对CYP2E1的药理抑制。在这项研究中，我们开发了一种由脂质纳米颗粒传递的RNAi疗法，并以每周一次的Lieber-DeCarli乙醇液体饮食喂养小鼠，治疗时间长达12周。这种基于RNAi的对CYP2E1表达的抑制减少了小鼠肝脏中的活性氧物种和氧化应激，并有助于改善小鼠的ALD症状。ALD模型大鼠肝脏脂肪堆积、肝细胞炎症和肝纤维化程度减轻。因此，本研究提示靶向CYP2E1的RNAi作为一种潜在的ALD治疗工具的可行性。
论文ID
题目：Amelioration of ethanol-induced oxidative stress and alcoholic liver disease by in vivo RNAi targeting Cyp2e1
译名：靶向CYP2E1的体内RNAi改善酒精性氧化应激和酒精性肝病
期刊：Acta Pharm Sin B
IF：14.903
发表时间：2023.2.24
通讯作者单位:江苏大学
DOI号：https://doi.org/10.1016/j.apsb.2023.01.009
主要内容
酒精性肝病是指长期饮酒引起的一系列肝病，包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化等。肝损害在ALD的整个阶段都是逐渐发生的。大约90%-95%的长期饮酒者会在肝脏中经历脂肪堆积并患上AFL。约10%-35%的AFL患者会发展为酒精性肝炎。此外，随着病情的恶化，20%-40%的AFL患者可能会发展为酒精性肝纤维化。此外，持续饮酒后，10%-15%的酒精性肝纤维化患者可能进展为酒精性肝硬变，3%-10%的患者可能进一步发展为肝癌。持续饮酒会使肝脏损伤逐渐加重。然而，对于ALD的治疗几乎没有特效可用，糖皮质激素经常单独使用或与己酮可可碱联合用于ALD的预先验证治疗，但糖皮质激素有显著的副作用，不适合长期治疗。美他多辛通常用于治疗急性酒精中毒，但不能直接改善肝功能。水飞蓟宾等天然抗氧化剂可通过减轻脂质过氧化反应来修复肝脏，虽然毒副作用低，但其生物利用度低，代谢速度快，使其迅速从体内消失。ALD的临床治疗策略是戒酒加药物干预，这是一个长期的过程，疗效差，患者依从性低。
除了在药物毒性反应中发挥作用外，细胞色素P450 2E1是一种关键酶，在大多数肝病的发生和发展中发挥作用。此外，在酒精性肝病、帕金森氏病、糖尿病、心血管疾病以及其他与氧化应激、脂肪变性、DNA和蛋白质损伤相关的疾病的病理过程中，CYP2E1起着关键作用。在本研究中，通过使用si-CYP2E1LNPs敲除小鼠体内的CYP2E1基因，成功地抑制了酒精诱导的小鼠氧化应激引发的ALD的发生和发展，这对其他由氧化应激引起的疾病具有很强的指导意义。
实验示意图，重复注射LNP形成的siRNA的时间表
根据我们的研究，ALD可在酒精暴露后4周内出现肝损伤和肝脏脂肪堆积。酒精灌胃8周后，小鼠肝脏损伤和脂肪变性进一步加重，出现重度酒精性脂肪肝。随着酒精暴露时间进一步延长至12周，小鼠酒精性肝损伤和脂肪肝的程度进一步加深。总之，根据暴露时间的不同，可以在小鼠身上诱导不同程度的酒精性肝损伤和脂肪肝。在本研究中，小鼠被喂以Lieber-DeCarli乙醇液体饲料，并每周两次给予酒精灌胃。酒精灌胃12周后，成功建立ALD小鼠模型。该模型存在肝损伤和脂肪肝，并伴有轻度炎症反应和纤维化反应。将小鼠分为三个不同的给药阶段：早期治疗组、中期治疗组和晚期治疗组。三个阶段经尾静脉注射siCyp2e1 LNPs。结果表明，si-CYP2E1LNPs对小鼠酒精性肝病有明显的治疗作用，其中早期治疗组疗效最好。SI-CYP2E1LNPs干预对ALD晚期也有较好的治疗效果。因此，越早给药，保护作用就越明显。
CYP2E1siRNA的体外筛选
已有报道称，酒精性肝细胞损伤主要由ROS和局部炎症引起，导致肝脏结构和功能损伤，最终导致肝细胞增多。过量的ROS靶向细胞膜上的多不饱和脂肪酸，从而产生丙二醛，作为ROS诱导的脂质过氧化的主要产物，丙二醛被用作氧化应激的生物标志物。丙二醛水平越高，细胞膜脂质过氧化越严重。超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶是还原剂，直接中和有毒活性产物，参与维持细胞的氧化还原平衡。检测各组动物肝组织中ROS、MDA、SOD、GSH、GSH-Px的含量。结果表明，酒精可导致丙二醛含量显著升高，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽含量显著降低。这表明肝脏的抗氧化能力降低，发生了脂质过氧化。同时，在ALD的不同阶段给予si-CYP2E1LNPs在一定程度上可以有效地减轻这种损伤。尤其是酒精性肝损伤早期治疗组大鼠血清中的SOD、GSH-Px、GSH水平显著升高，而丙二醛水平明显降低，表明肝脏抗氧化能力明显恢复。ROS合成的重要酶是NADPH氧化酶，它由膜相关亚基P47Phox、P67Phox和GP91Phox组成。清除生物体中过量自由基的系统由抗氧化酶组成，如Gshpx、Gshd和SOD1。我们的结果表明，酒精可显著增加氧化应激，si-CYP2E1LNPs抑制酒精诱导的P47Phox、P67Phox和Gp91Phox基因的mRNA表达增加，并使Gshpx、Gshd和SOD1基因的表达水平恢复到正常水平。因此，si-CYP2E1LNPs降低了ROS水平和相关的氧化应激。
SiCYP2E1LNPs对氧化应激和脂肪变性相关基因表达的影响
在本研究中，在持续饮酒的同时，在ALD的不同时间引入si-CYP2E1LNPs，显示出较好的整体ALD治疗效果，且这种影响随着给药时间的延长而加深。与水飞蓟素相比，si-CYP2E1LNPs对ALD中晚期的治疗效果更好，对肝脏炎症和纤维化等病理特征也有更好的治疗效果。此外，与其他治疗ALD的方法相比，si-CYP2E1LNPs每周一次的治疗频率大大减少了服药频率。这反过来又有可能改善患者的服药依从性，并增加ALD药物治疗的可行性。通过siRNA LNPs靶向抑制慢性酒精性脂肪变性、炎症和肝纤维化，验证了在体内有效的抑制CYP2E1mRNA可以治疗酒精性酒精性肝病，并且作为一个关键靶点对未来酒精性肝病的治疗具有重要的指导意义。这是第一份评估siRNA LNPs在减轻酒精相关性肝病方面的疗效的报告。尽管许多传统药物和天然药物对细胞和动物模型的调节作用已被广泛研究，但还没有一种药物应用于临床。SiCYP2E1LNP在体内实现了对CYP2E1mRNA的更有效和持久的调节作用，并缓解了ALD，说明RNAi治疗在未来开发新的治疗方法方面具有巨大的潜力。然而，仅对si-CYP2E1LNPs进行了体内疗效研究。因此，在稍后阶段正在考虑进行体内安全性评估的其他试验。
微流控si-CYP2E1LNPs击倒Cyp2e1，导致氧化应激减少，从而减少脂质合成，促进脂肪酸降解，减轻炎症反应
总结
综上所述，基于RNAi的靶向细胞色素P4502基因的表达可以有效地抑制ALD小鼠模型的发展，验证了RNAi作为一种潜在的治疗工具的可行性。
原文链接
https://doi.org/10.1016/j.apsb.2023.01.009
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国自然专家简介
国自然专家一：T教授，博士生导师。先后主持973计划课题、国家自然科学基金重大研究计划课题等国家级重大项目。担任过多次基金项目的评审专家，将会以评审专家的角度来解析并回答上述的一系列问题，并且将与学员们采取现场互动的方式来授课，点评学员所写的标书存在的问题，赏析中标标书，让学员能在现场模拟撰写！自1998年来，年平均一对一辅导撰写国家自然科学基金60余份，平均中标率达50%以上。特别擅长评审的研究方向是：肠道微生物，代谢，中医药，药理，肿瘤，非编码RNA，免疫，衰老，脑神经科学等领域。
国自然专家二：
M教授，博士生导师。北京大学博士，斯坦福大学博士后，欧盟Erasmus+访问学者。主要从事肿瘤分子生物学，药理学等研究，在相关领域取得了令人瞩目的成就。在Blood、Cancer Research、Oncogene、Journal of Clinical Investigation、Journal of Biological Chemistry等著名杂志已发表研究论文60多篇，IF>400。主持重点国合等项目。评审重点、重点国合、优青、杰青等不同类型项目，经验丰富。
W教授，国内某高校教授，博士生导师。作为课题负责人先后主持肠道菌群与代谢组学研究国家级课题和部省级课题多项，并先后承担多项973计划课题中有关代谢组学方面的研究课题。所带领的团队主要采用代谢组学、生态学、生物信息学、分子生物学等多种宏观与微观相结合的方法，从宿主代谢与菌群微生态交互作用的角度对胃肠道疾病、神经退行性疾病的菌-肠-脑机制进行研究。目前已发表多篇SCI论文，在肠道菌群、代谢组学数据分析策略等相关领域受到了广泛关注和认可。
国自然专家四：
国内知名⾼校教授，博⼠⽣导师，曾在海外从事微⽣态与营养健康相关研究10余年，主要涉及肠道炎症反应、⼤肠癌发病机制以及肌⾁和脂肪⼲细胞⽣理的分⼦机制的研究，拥有⽣物医学、分⼦⽣物学、细 胞⽣物学和⽣物化学等⽅⾯深厚的理论研究及实验操作经验。近年来在Journal of Clinical Investigation, Nucleic Acids Research, PNAS,Cell Metabolism, Gastroenterology 等国际权威期刊发表SCI学术论⽂31篇，总影响因⼦~200，累计参与主持多项国⾃然基⾦及美国国⽴卫⽣研究院(NIH)资助的科学研究基⾦，申请发明专利4件，授权软件著作权1件。近年来在中国肠道⼤会、EMBL Conference、中华医学会等⾼⽔平会议进⾏微⽣物领域专题汇报，获得了业界的⼴泛关注和认可。
国自然专家五：
S教授，博士生导师，研究员，百名青年学科带头人。主要从事单细胞组学、空间组学及表观组学的生物信息分析与调控机制解析。
S教授长期从事单细胞以及表观组学的生物信息学分析及功能研究。阐明RNA修饰调控多种生理（胚胎发育、精子发生、神经发育等）和病理过程（肿瘤发生、肥胖等）的分子机理，并通过单细胞组学揭示癌症等疾病发生的分子机制。其科研成果以(共同)第一作者发表于Nature，Nature Cell Biology，Science Translational Medicine，Molecular Cell, Cell Research等多个具有国际影响力的权威期刊上，引用超过4000次。
国自然专家六：
H教授，博士生导师，主持国家重点研发计划“干细胞及转化研究”重点专项（首席科学家）、国家自然科学基金（5项）、国家重点研发计划发育编程及其代谢调节重点专项PI、上海市科委重大课题等30余项课题，累计经费9600万元。发表论文72篇，其中SCI论文42篇，总影响因子323。以第一作者或通讯作者（含共同）发表SCI论文25篇，总影响因子186，4篇影响因子大于20。申请专利11项，其中5项已授权，国际PCT专利1项。参加专著和国家统编教材编写9部，承担教学课题和学生创新指导课题8项。研究成果被评为中国科学十大进展、细胞出版社中国年度论文、上海市优秀发明金奖、上海医学科技奖二等奖、浦东新区科技进步一等奖等。
国自然专家七：
Q教授，博士生导师，博士生导师，重塑相关心血管疾病教育部重点实验室副主任。兼中国生理学会副秘书长及中国病理生理学会常务理事。长期从事代谢异常与重塑相关心血管疾病的发病机制及潜在靶点研究。在Circulation、Hepatology、J Hepatol等杂志发表论文50余篇。主持国家自然科学基金重大研究计划等项目6项，参与科技部重点研发计划2项，入选北京市海外高层次人才计划及教委长城学者计划等。
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X教授，脂糖代谢实验室/重庆市重大代谢性疾病转化医学重点实验室，主任、教授、博士生导师、内分泌与代谢学科带头人；中国侨界(创新人才)贡献奖获得者；美国内分泌学会高级会员、美国生理学会、美国糖尿病协会会员；Journal of Neuroendocrinology等期刊审稿专家。近五年，主持国家级项目3项（国家自然科学基金重点项目1项、面上项目2项），省部级课题2项；发表通讯作者SCI 论文5篇；获得中华医学会科研奖励1项；培养博士1人，硕士16人。疾病转化医学重点实验室，主任、教授、博士生导师、内分泌与代谢学科带头人；重庆市生物化学与分子药理学重点实验室PI、脂糖代谢实验室实验室执行主任。中国侨界(创新人才)贡献奖获得者；美国内分泌学会高级会员、美国生理学会、美国糖尿病协会会员；Journal of Neuroendocrinology等期刊审稿专家。近五年，主持国家级项目3项（国家自然科学基金重点项目1项、面上项目2项）。
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L教授，医院病理科主任、博士生导师、病理学科带头人；重庆市中青年骨干教师，霍英东青年教师奖获得者；USCAP会员，国际老年痴呆协会会员，中国神经科学学会会员，多个国内外期刊审稿专家。近五年，主持国家级项目4项（国家自然科学基金面上项目3项、青年基金项目1项），省部级课题3项；发表通讯作者SCI 论文二十余篇；培养博士1人，硕士23人，曾作为访问学者、访问教授分别留学加拿大、美国。
国自然专家十：
中科院研究员，中国科学院研究生院生物化学与分子生物学博士，2001-2008年任职于美国罗约拉大学医学中心神经科学部期间，曾与著名神经内分泌学专家Louis Van de Kar 教授、George Battaglia教授等合作从事神经药理学研究，共同主持和参与多项美国心脏协会和美国国家卫生部(NIH)项目。2008年回国以来主持多项国自然，评审国自然经验丰富。
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