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来源：科学百晓生收集编辑：Sylvia
▲第一作者：Xuan Mei, Junlang Li
https://doi.org/10.1038/s41563-023-01475-7自2019年底出现以来，严重急性呼吸道综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）已在全球范围内造成超过6亿人次的感染，超过659万人因冠状病毒病2019（COVID-19）而死亡（截止到2022年11月2日）。当前，快速传播的SARS-CoV-2变异体的激增，对快速、广谱抗病毒感染策略的需求十分急切。本研究报告了一种基于可吸入生物粘性水凝胶的抗SARS-CoV-2感染的物理屏障，名为球形水凝胶吸入增强肺部防御（SHIELD）。该水凝胶可以通过干粉吸入器方便地给药，SHIELD颗粒形成一个致密的水凝胶网络，覆盖在气道上，从而增强扩散屏障特性，最终限制病毒的渗透。SHIELD的保护作用首先在小鼠身上得到证实，它能抵抗两种具有不同变异尖峰蛋白的SARS-CoV-2伪病毒。令人震惊的是，在非洲绿猴身上，一次SHIELD的吸入就能提供长达8小时的保护，有效减少SARS-CoV-2 WA1和B.1.617.2（Delta）变种的感染。值得注意的是，SHIELD是用食品级材料制成的，不影响正常的呼吸功能。这种方法可以为人们提供额外的保护，防止SARS-CoV-2和其他呼吸道病原体。1、SHIELD通过三个步骤生效（图1a）：吸入（i）、膨胀（ii）和粘附（iii）。2、SHIELD颗粒的制备是采用油包水乳化技术进行的。由此产生的微粒子是由PAAc-NHS酯和明胶的交联网络组成的，它提供了一种具有强大机械性能的粘液粘附剂。在乳化过程中，物理交联促进了松散的水凝胶结构向致密的球形结构转变。扫描电子显微镜（SEM）成像显示，SHIELD颗粒作为粉末被很好地分散，尺寸低于5μm（图1b）。SHIELD颗粒的空气动力学直径在0.5-5μm之间（图1c），有利于通过惯性压迫和沉降在肺部深处沉积。SHIELD颗粒在水中膨胀后形成水凝胶状结构（图1d）。膨胀动力学被记录为体积变化（图1e）。SHIELD颗粒的体积在10分钟内增加了10倍以上。3、膨胀后，SHIELD颗粒相互交联，形成水凝胶网络结构（图1f）。傅里叶变换红外光谱图显示，在SHIELD物品中存在PAAc-NHS酯（图1g）。1、本研究假设SHIELD网络可以通过其膨胀和粘附行为加强粘液屏障。由于猪气管内的气道粘液量有限，本研究收集了猪胃粘液进行试验。胃粘液蛋白由粘液蛋白5AC（MUC5AC）和粘液蛋白6（MUC6）基因编码，而气道粘液蛋白由MUC5AC和粘液蛋白5B（MUC5B）基因编码。MUC5AC、MUC5B和MUC6具有序列相似性和共同的大分子特征，它们都有富含半胱氨酸残基的区域（Cys域）。与单独的粘液相比，粘液+SHIELD表现出更密集的形态，多孔性更小（图2a），这可能是SHIELD颗粒与粘液相互作用的结果。2、本研究通过小麦胚芽凝集素染色和三维气道模型的显微镜检查，进一步观察了SHIELD颗粒与粘液蛋白的相互作用。1H核磁共振（NMR）光谱证实，在粘液+SHIELD中出现了5.5和8 ppm的化学偏移增强（图2b），表明羧基（SHIELD颗粒上）和一级胺基（粘液上）之间存在相互作用。与SHIELD本身相比，强度更高，更多的酰胺键可能在SHIELD颗粒和粘液之间形成。3、流变学研究（图2c,d）显示，粘液的弹性（G′）和粘性（G″）模量都随着SHIELD颗粒的膨胀而增加。为了模拟病毒通过粘液屏障的渗透，本研究使用了与病毒大小相同的聚苯乙烯颗粒。通过跟踪颗粒的轨迹，发现在粘液中加入SHIELD颗粒后，聚苯乙烯颗粒的布朗运动大大减少（图2e）。扩散受限是通过均方位移的量化来评估的（图2f）。▲图3|在小鼠模型中，SHIELD的吸入阻止了SARS-CoV-2伪病毒的进入。1、在进行SARS-CoV-2活体模型测试之前，首先在SARS-CoV-2假病毒挑战的小鼠模型中测试SHIELD的保护作用（图3a）。小鼠的吸入是通过改良的“只用鼻子”装置进行的，剂量为每公斤体重3毫克SHIELD颗粒。2、如图3b所示，一次吸入8小时后，SHIELD颗粒在肺部的信号仍然很高，但从8小时到24小时下降，48小时后信号最小，表明SHIELD颗粒被清除。一项对照研究表明，Cy7标记的SHIELD颗粒并不干扰体内成像系统（IVIS）的发光/荧光信号。至于出现在肝脏的荧光信号，本研究推测也是通过空气到血液的转运后的肝脏代谢进行清除。此外，粘液周转也可以通过粘液纤毛清除机制促进SHIELD颗粒的清除。3、苏木精和伊红染色和免疫组化（IHC）表明，吸入的SHIELD颗粒在支气管（图3c）和小支气管（图3d）的表面都有涂层。为了研究SHIELD颗粒对变种提供的保护性能，本研究在SHIELD吸入4小时、8小时或24小时后，将同时具有D614G突变和D614G、E484K、N501Y和K417N突变的SARS-CoV-2伪型病毒鼻内灌入小鼠体内。IVIS成像显示，预先吸入SHIELD颗粒可以阻断病毒在肺部的滞留（带有D614G突变的杆状病毒假型），4小时的阻断效率为75.8%，8小时为57.7%，24小时为17.7%（图3e)。▲图4| SHIELD吸入法可保护非洲绿猴免受SARS-CoV-2感染1、为了评估SHIELD方法的保护效果，本研究使用原始SARS-CoV-2 WA1和B.1.617.2（Delta）变体进行了一项非人类灵长类动物试验研究。在病毒挑战前8小时，使用SARS-CoV-2 WA1或B.1.617.2（Delta）变体，通过鼻内和气管内途径进行SHIELD吸入（图4a）。在第1、2、4和7天收集鼻拭子和支气管肺泡灌洗液。通过实时PCR与病毒亚基因组RNA（sgRNA；指示病毒复制；图4b）的逆转录进行病毒负荷检测。2、总的来说，用SHIELD保护的动物的病毒负荷量比对照组动物低50倍到300倍（图4c）。SHIELD中的化学物质并不影响PCR实验的完整性。本研究展示了SHIELD方法提供了对SARS-CoV-2 WA1和B.1.617.2（Delta）变体感染的保护。由食品级材料制成的SHIELD颗粒既有效又安全，在不影响正常肺部功能或导致毒性的情况下发挥作用。与疫苗不同，SHIELD方法增强了粘液的扩散屏障特性，为病毒感染提供物理保护。作为一种先天的防御机制，气道粘液层在捕获病原体并使其远离宿主上皮细胞表面方面起着关键作用。粘液的主要成分是粘液蛋白（0.2-5% w/w），它是具有蛋白质核心和碳水化合物侧链的糖蛋白。为了穿透粘液屏障，病毒已经演化出各种策略，如分泌粘液溶解酶或改变病毒的表面特性。研究报道，SARS-CoV-2病毒同时感染人类气道中的纤毛细胞和分泌细胞，导致其在上气道的高效传播。血管紧张素转换酶2（ACE2）的存在被证实存在于运动的纤毛中，而且~80%的人类呼吸道上皮（从鼻腔到下支气管）被纤毛密集地覆盖。这也为SARS-CoV-2的结合和进入宿主细胞提供了一个很大的表面积。因此，理想的做法是设计一种策略，在不影响正常的粘膜纤毛清除特性的情况下，加强粘膜屏障。