AAA+ ATPase Cdc48/p97从大分子组件或膜中调用多泛素化蛋白用于蛋白酶体降解【1】，在其识别打开底物的过程中，许多辅助蛋白协助发挥作用【2】，最常见的就是Ufd1/NpI4（UN），它对K48链有明显的的偏好性【3】。以往研究提示Cdc48通过NpI4介导的启动泛素展开处理聚泛素链【4】，但其具体机制仍不清晰, Ufd1的UT3结构域被认为在底物招募中起关键作用【5】，但Ufd1在整个过程中的具体作用尚不明确。 2023年2月2日，加州大学伯克利分校的Andreas Martin在Molecular Cell上发表了题为The Ufd1 cofactor determines the linkage specificity of polyubiquitin chain engagement by the AAA+ ATPase Cdc48的文章，揭示了ATP酶进行底物处理时，在以长度、链接及位置特异的方式处理底物附着的多聚泛素链过程中，Cdc48的辅因子Ufd1/NpI4是如何被利用的。 为监控Cdc48结合多聚泛素链过程中的每一个步骤，作者首先开发了针对起始泛素展开和通道插入的独立FRET实验。在针对起始泛素展开的FRET实验中，作者发现在第一条最邻近的泛素Cy3供体染料和第二条泛素上Cy5受体染料之间FRET效率会很高。在随后的实验中，他们发现在非水解ATP类似物ATPγS存在的情况下，链中第一个或第二个泛素会被作为起始子打开而结合NpI4，使FRET进入一个低效率状态。接下来，作者测量了泛素链结合以及起始展开步骤的时间点，他们将Cy3Ub-Cy5Ubn，Cdc48-UN，ATPγS混合，监测Cy3荧光随时间的变化，作者发现存在快速和慢速两个时期，在快速时期供体荧光会呈现两次增长，但在Cy3Ub-Cy5Ubn，Cdc48-UN，ATP混合的情况下作者只观察到了荧光单一的指数增长，且其反应动力学更快，这说明Cdc48快速结合多聚泛素链是不依赖于ATP水解的。在针对起始泛素插入Cdc48马达的实验中，作者则收集起始泛素N端Cy3供体染料和Cdc48处理通道底部Cy5受体染料之间的信号，他们观察到在ATPγS存在时，UN与Ub-Cy3Ub-Ubn，Cy5Cdc48的混合会导致Cy3荧光的减弱和Cy5荧光的增强，动力学结果显示两次指数性减弱且时间与快速时期一致，这说明泛素展开是Cdc48结合的限速步骤。 作者在K48链中观察到第二个位置起始泛素的插入，于是他们想知道最邻近的泛素是否也可以作为起始子。作者发现当Cy3标记的第一个泛素与Cy5Cdc48-UN混合时，Cy3荧光信号不改变，而当染料附着于第二个泛素的N端时，Cy3荧光信号则淬灭，这说明Cdc48对于泛素的识别需要起始子与另一邻近泛素相连。而当泛素的N端与第二个泛素的C端融合时，荧光猝灭又不会发生，这说明Cdc48的识别具有链接类型特异性，即邻近泛素必须位于起始泛素之前，也就是K48链接。进一步地，作者探究了其背后机制，通过UT3-泛素复合物AlphaFold模型，作者发现Ufd1的UT3结构域负责感知邻近泛素，UT3与K48链的结合是Cdc48-UN展开起始的重要步骤。 起始子近端泛素对于Cdc48的识别是必需的，那么以往研究中报道的远端泛素又起着什么样的作用呢？作者纯化了不同长度的泛素链用于插入实验，发现含有更高比例四聚体或更长链的片段信号变化更强烈，提示起始子远端泛素增加了Npl4的链亲和性，促进起始展开和Cdc48插入。随后，作者测量了底物打开的动力学，发现快速时期的时间长度与泛素链长度负相关，最小可达4.4 ± 0.1 s，这比任何一个之前报道的Cdc48或p97底物打开的时间都要快一个数量级，Cdc48以每秒45个残基的速度移动底物。此外，Npl4顶部两个泛素结合位点的占据会增强起始泛素的结合和底物处理，远端泛素与Npl4顶部结合位点的互作在高效地将起始子插入中心通道的过程中扮演着重要作用。远端泛素打开和移动的缺失会拖慢底物释放，成为Cdc48-UN降解底物过程中的限速步骤。 综上，作者基于FRET试验揭示了Cdc48-UN处理转移泛素链的完整动力学，并描述了链长度的依赖性和底物处理的限速步骤，发现Cdc48利用Ufd1的UT3结构域来结合启动链近端的泛素，这决定了Cdc48-UN的链接特异性。 原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.01.016
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参考文献
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