点评 | 王琳淇（中科院微生物研究所）、黄亿华（中科院生物物理研究所）、倪明（同济医院）侵袭性真菌感染每年造成超过150万人死亡，临床多发于免疫缺陷、器官移植、重症新冠肺炎等高危人群，患者病死率极高【1】。这一严重疾病的治疗却面临药物种类极为有限、药物毒副作用大、耐药菌株不断出现等严峻问题【2】，因此，迫切需要开发多种新型抗真菌药物以应对当前需求。β-1,3-葡聚糖是真菌细胞壁特有的核心多糖成分，其合成途径是开发抗真菌药物的关键靶点，成功的靶向药物包括临床上广泛使用的棘白菌素类一线药物以及近期引起广泛关注的新药艾瑞芬净（ibrexafungerp）和瑞扎芬净（rezafungin）【3,4】。然而，长期以来，对真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖的合成机制缺乏了解，是领域内面临的瓶颈问题。虽然一些间接证据提示了FKS1是可能的葡聚糖合成酶，但至今仍缺乏二者联系的直接证据。另外，棘白菌素类药物的抗真菌机制是什么？广泛出现的耐药性来源是什么？这一系列与临床紧密联系的关键问题仍不清楚，严重阻碍了该领域新药创制的发展。2023年3月22日，华中科技大学同济基础医学院、细胞架构研究中心于洪军教授、张敏副研究员，与南方科技大学生命科学院张明杰院士、刘晓天副研究员组成的联合研究团队在Nature期刊发表了题为“Structural and mechanistic insights into fungal β-1,3-glucan synthase FKS1”的研究论文，解开了困扰领域多年的抗真菌药物重要靶点-真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖的合成及其靶向药物的耐药产生机制之谜，对于应对侵袭性真菌感染这一临床问题具有重要科学意义。FKS1属于大分子量的膜蛋白，且活性对环境非常敏感，其功能和机制的解析一直是世界性难题。研究团队利用在糖生物学和膜蛋白领域积累的研究经验，巧妙的设计并筛选到了影响FKS1活性的重要突变：一定条件下高活力的S643P突变和丧失活力的K1261A突变，并通过长期摸索获得了关键的提纯和反应条件。在此基础上，对体外聚合产物应用糖苷酶水解、薄层层析、糖苷键甲基化色谱质谱分析等手段进行多角度分析，首次直接证明了FKS1可以特异性合成真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖，解决了领域内的关键问题（图1a-d）。研究人员据此建立了FKS1活性的非放射性检测体系，相比于传统上繁琐的放射性标记检测，更有助于建立简易、高效的药物筛选体系，具有非常重要的应用价值。图1. FKS1特异性合成真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖的功能和机制研究。(a) FKS1的功能及其靶向药物的作用模式图; (b-d) FKS1的活性及其体外聚合产物表征分析; (e) β-1,3-葡聚糖合成机制的系统性突变研究; (f-h) FKS1对棘白菌素药物的敏感性实验和耐药性来源分析。为了从分子水平更深入的认识真菌β-1,3-葡聚糖的合成机制，研究人员应用冷冻电镜技术首次报道了FKS1的高分辨率结构（3.4 Å），并鉴定出了两个关键功能区域：在胞质一侧，GT结构域与跨膜结构域围绕形成一个近细胞膜的催化反应中心；在跨膜结构域中，跨膜螺旋TM5-8、TM11-12以及界面螺旋IF1围绕形成了一个半闭合的聚糖跨膜转运通道。通过系统性突变研究以及体内、体外功能分析，研究人员进一步提出并确定了FKS1合成β-1,3-葡聚糖的催化和转运机制，在多种致病真菌中高度保守，对于广谱抗真菌药物的开发具有非常重要的意义（图1e）。在探索靶向药物作用机制的过程中，研究人员意外的发现caspofungin（一种代表性棘白菌素类药物）对FKS1的作用因纯化条件而异，甚至表现出截然相反的效应，这打破了对此类药物作用机制的传统认知，反映了FKS1功能对膜环境的敏感性。对应的，结构分析揭示了耐药相关热点区域的空间分布和特点：位于紧邻的三股跨膜螺旋TM5-6和TM8上，并结合有多个高度有序的脂分子，形成潜在的药物结合位点（图1f-g）。药物活性测试证实了这些位点的代表性突变会显著降低FKS1对药物的敏感性，进而产生耐药性。研究人员最终解析了临床上最常见的代表性耐药突变体FKS1-S643P的电镜结构（3.5 Å），结构比对分析发现了该突变引发了耐药热点区域的显著构象变化，并导致了附近脂分子的重排（图1h）。这些结果揭示了耐药性产生的一种独特分子机理，为解决临床耐药问题提供了重要启示。综上所述，该研究工作突破性的解决了抗真菌药物开发领域的关键问题-真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成的分子机制，揭示了棘白菌素类一线抗真菌药物的耐药产生机理。研究成果不仅有助于应对日益严峻的真菌耐药问题，也会有力推进新型抗真菌药物的开发进程，对于解决侵袭性真菌感染这一重大临床问题至关重要。华中科技大学于洪军教授、张敏副研究员，南方科技大学刘晓天副研究员为论文共同通讯作者。华中科技大学博士研究生胡鑫霖、杨坪为共同第一作者。此次在Nature期刊发表的论文是该团队在继“抗真菌药物尼克霉素Z抑制真菌细胞壁几丁质合成的分子机制研究”（2022年发表于Cell Discovery 【5】）之后，基于在糖生物学领域积累的研究基础，聚焦抗真菌药物靶点领域的又一项进展。《人间传染的病原微生物目录（征求意见稿）》（2021年版）指出真菌类病原微生物种类已由2006年版本所示59种上升至166种，揭示真菌感染已成为当前威胁我国人民健康安全的关键因素之一。有限种类的抗真菌药物和不断出现新的耐药菌株，如近年来出现的多重耐药的耳念珠菌（Candida auris），给感染患者的治疗带来了严峻挑战。基于病原真菌威胁日益严重，2022年10月25日，世界卫生组织针对真菌病颁布了首份真菌重点病原体清单，旨在推动全球对真菌研究与防控的重视。FKS1参与合成真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖，是棘白菌素类一线抗真菌药物的靶点，临床研究也发现FKS1的突变会导致棘白菌素耐药性的产生。于洪军/刘晓天/张敏研究团队以结构研究结合完整的功能实验，首次建立了FKS1这一重要药物靶点的工作模型，并揭示了耐药突变的空间分布规律以及耐药性产生的原因。这一进展推动了对真菌β-1,3-葡聚糖生物合成机理的关键认识，为抗真菌药物的开发提供了基础，而且对于临床应对耐药真菌感染也具有重要意义。多糖作为一类重要的生物大分子，广泛存在于不同的生命体系和自然界中。如常见的肽聚糖、纤维素、脂多糖（LPS）和细菌的荚膜多糖（CPS）等等。由于多糖种类繁多，结构千变万化，针对多糖的疫苗研发具有很大的挑战性。然而，不同多糖的合成与转运的通路相对保守，参与多糖合成与转运通路中的蛋白因而都是潜在的、重要的抗生素研发靶标。在真菌中，葡聚糖（Glucan）是细胞壁的主要成分，为其存活所必需。葡聚糖的合成由膜整合合酶（membrane-integrated synthase）FKS，通过β-1,3-糖苷键将单个葡萄糖聚合形成。FKS是目前广泛使用的抗真菌药物（如echinocandin，ibrexafungerp以及处于临床阶段的rezafungin等）的靶点，但由于缺乏对FKS工作机理的理解以及精细的三维结构信息，使得针对FKS的新药研发，以及已有药物效果改善的研究进展缓慢。华中科技大学于洪军团队和合作者的这篇nature论文，报道了来源于酿酒酵母FKS1以及耐药突变体FKS1（S643P）高分辨率冷冻电镜结构，首次展示了糖基转移酶48家族（GT48）含有跨膜结构域（TM）的完整结构。FKS1整体包含三个主要结构域，除GT48和跨膜结构域外，结构中还发现了独特的AC结构域与GT48结构域之间的相互作用。研究者在高分辨率结构的基础上，揭示了AC结构域氨基酸（R319）对FKS1活性的影响；结合功能研究，证明了FKS1 GT48结构域的催化机制与细菌纤维素合酶BcsA类似；发现了跨膜结构域内存在可能的葡聚糖转运通道。非常期待后续工作进一步揭示FKS1（S643P）突变导致耐药性的原因以及FKS1与相关抑制剂的复合物结构信息，这将对深刻理解真菌耐药机理和新抗真菌药物研发具有重要作用。近年来，随着造血干细胞移植、骨髓移植、实体器官移植技术在临床的广泛开展、各种新型免疫抑制剂和化疗药物在临床的大量应用，侵袭性真菌病的发病率及病死率呈持续上升趋势，而且新发致病菌和耐药菌种不断出现，但抗真菌药物的种类非常有限，难以满足临床需求【6,7】。β-1,3-葡聚糖是真菌细胞壁的特有成分，是抗真菌药物的重要作用靶点。棘白菌素类抗真菌药物可以选择性作用于真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成，对包括氟康唑耐药的光滑念珠菌和克柔念珠菌在内的念珠菌属具有杀菌活性，对曲霉和耶氏肺孢子菌也有一定的抗菌活性，并且耐受性良好，引起肝毒性、肾毒性或严重药物相互作用的可能性相对较低，因此被广泛用于上述侵袭性真菌病的治疗，但由于耐药导致的治疗失败近年来也屡有报道【8,9】。于洪军联合刘晓天、张敏团队的工作不仅首次直接证明了FKS1可以特异性合成真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖、确定了其中的催化和转运机制、建立了FKS1活性的非放射性检测体系，还揭示了棘白菌素类抗真菌药物耐药产生的机理，对于新的抗真菌药物的研发以及解决棘白菌素耐药问题具有极其重要的应用价值。华中科技大学同济基础医学院于洪军教授团队长期从事疾病相关蛋白复合物的机制研究，特别关注真核生物糖基化的分子机制、靶向干预及其在感染等疾病中的应用，取得了一系列优秀成果（相关工作发表在Nature、Cell、Nature Chemical Biology 2篇、PNAS、Nature Communications等），真诚欢迎感兴趣的博士后、研究生加入。https://doi.org/10.1038/s41586-023-05856-51 Brown, G. D. et al. Hidden killers: human fungal infections. Science translational medicine 4, 165rv113 (2012).
2 Fisher, M. C., Hawkins, N. J., Sanglard, D. & Gurr, S. J. Worldwide emergence of resistance to antifungal drugs challenges human health and food security. Science 360, 739-742 (2018).
3 Perfect, J. R. The antifungal pipeline: a reality check. Nature reviews. Drug discovery 16, 603-616 (2017).
4 Hoenigl, M. et al. The Antifungal Pipeline: Fosmanogepix, Ibrexafungerp, Olorofim, Opelconazole, and Rezafungin. Drugs 81, 1703-1729 (2021).
5 Wu, Y. et al. Structures and mechanism of chitin synthase and its inhibition by antifungal drug Nikkomycin Z. Cell Discov 8, 129 (2022).
6 Formanek, P. E. & Dilling, D. F. Advances in the Diagnosis and Management of Invasive Fungal Disease. Chest 156, 834-842 (2019).
7 Lee, Y., Puumala, E., Robbins, N. & Cowen, L. E. Antifungal Drug Resistance: Molecular Mechanisms in Candida albicans and Beyond. Chemical reviews 121, 3390-3411 (2021).
8 Tissot, F. et al. ECIL-6 guidelines for the treatment of invasive candidiasis, aspergillosis and mucormycosis in leukemia and hematopoietic stem cell transplant patients. Haematologica 102, 433-444 (2017).
9 Pristov, K. E. & Ghannoum, M. A. Resistance of Candida to azoles and echinocandins worldwide. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 25, 792-798 (2019).
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