多肽介导的生物大分子递送是一类具有很大潜力的递送方法。其中，细胞穿膜肽是一种较短（通常少于20个氨基酸）、具有细胞膜穿透性的多肽，在疾病治疗中具有很大的药物递送潜力。目前，反义磷酸二胺吗啉代低聚物（PMO）与CPP偶联的递送的方法已在Duchenne肌营养不良综合征的剪切效果矫正治疗上进入二期临床阶段；此外，FDA近期批准了聚阳离子肽（包括Daxxify）。然而，目前还没有基于CPP的疗法进入商业市场，而更为新颖而有效的CPP序列设计方法或许可以极大地加速这一进程。常用的CPP序列也称为蛋白质转导域，通常来自病毒和转录蛋白的跨膜部分，例如，聚精氨酸肽 TAT源自 HIV 的转录反式激活因子蛋白质，并被发现渗透到细胞核和目标基因表达位置。由此序列出发，可以设计一些用于递送PMO药物的合成肽，例如Bpep序列，它依赖于聚精氨酸序列以改善摄取、依靠非天然残基β-丙氨酸和6-氨基己酸增加在内吞小泡中的逃逸。目前已经出现了包括合成分子进化以及理论计算的CPP设计方法，然而这些方法均是依赖L-氨基酸构型的设计方法。尽管氨基酸立体化学是否会影响细胞膜穿透能力仍然没有定论，但比较肯定的是CPP掺入非天然氨基酸之后将获得更大的化学空间以及更好的蛋白酶稳定性。此外，非天然氨基酸更适合与磁珠偶联后进行合成（OBOC）的方法。

在这篇文章中，作者在课题组之前发展的可以识别靶向红细胞的D肽的体内亲和力选择-质谱法（AS-MS）基础上，推出了结合CPP多肽文库设计与AS-MS选择方法的新型CPP多肽设计及筛选方法：细胞穿透选择-质谱法（In-Cell Penetration Selection–Mass Spectrometry，In-Cell PS-MS）。在此方法的多肽设计部分，作者设计了多肽内的生物素手柄、click手柄、胰酶切割位点、含有D型氨基酸和非天然氨基酸的可变区域和C端的CPP基序（如图1）。其中，引入非天然氨基酸的目的在于增加细胞穿膜肽的化学多样性和穿膜能力，以及增加这些穿膜肽逃避蛋白酶切割的能力。

接着，作者将设计并合成完成的穿膜多肽与细胞相互孵育，并进行清洗及消化，以减少非特异结合的部分，接着对进入细胞内的穿膜肽进行质谱的鉴定，从而得到能够高效进入细胞内的穿膜肽序列，整个工作流程如图2。

通过对得到的多肽序列进行鉴定，作者筛选出仅进入细胞质的多肽序列（Cyto1a, Cyto1b）和存在于全细胞提取物中的（WC1c, WC1d），并通过细胞内吞抑制剂处理后的PMO递送效果推断这些穿膜肽通过细胞网格蛋白介导的胞吞作用进行递送，同时也对筛选出的Cyto1a穿膜肽递送后的细胞定位进行了观察（图3）。

总的来说，作者开发了一种新型的穿膜肽设计及筛选方法（In-Cell PS-MS），为多肽介导反义核酸药物递送方法的发展提供了一种新的策略。随着PMO药物在疾病治疗领域的不断推动，这类多肽介导的递送效率的优化及评估也将具有更加重要的意义；而这篇文章提供的具体策略及方法发展思路也为这一领域提供了新的范式。