本文刊载于《中国生物工程杂志》2022年第12期。转载引用请注明：王琳, 陈雅如, 程湄婕, 宋浩, 曹英秀. 微生物几丁质酶研究进展及应用. 中国生物工程杂志, 2022, 42(12): 101-110. doi:10.13523/j.cb.2205020
摘 要
摘要：几丁质由N-乙酰-D-氨基葡萄糖聚合而成,是自然界中仅次于纤维素的第二大类聚合物。微生物几丁质酶来源丰富,是生物降解或利用几丁质的主要媒介。野生型菌株几丁质酶产量低、活性弱,故近年来有关几丁质酶的研究侧重于对其产量及催化活性的提升等方面。此外,几丁质酶具有水解病原真菌细胞壁、破坏害虫体壁、生产N-乙酰氨基葡萄糖寡聚体或单体的应用价值,在医药、农业、食品加工等领域表现出巨大的市场潜力。综述微生物几丁质酶的来源、分类及工程改造,为后续几丁质酶的研究及开发利用提供参考。
关键词：几丁质酶; 几丁质; 生物炼制; 壳寡糖; 生物医学应用
几丁质,又称甲壳素,由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine,GlcNAc)聚合而成,是仅次于纤维素的第二大类天然高分子化合物[1]。食品加工行业每年产生的富含几丁质的虾壳、蟹壳及真菌菌丝体等废弃物达600万~800万吨[2],若能将其转化为有价值的物质或能源,将具有可观的经济效益。工业中对几丁质的利用通常为化学法,具有简单、高效的优点,但长时间高温、酸碱处理会导致产品质量下降、副产物多、设备腐蚀,同时废气、废液的排放也存在环保问题[3]。目前,对几丁质的研究转向了更加环保的生物利用法,利用几丁质酶(chitinase,EC3.2.1.14)来降解几丁质是一个主要途径。
几丁质酶是特异性催化裂解几丁质糖苷键,产生低聚寡糖或单糖的一类酶的总称。几丁质酶可以由细菌、真菌、病毒、昆虫、植物和动物等多种生物体产生[4]。其中,微生物来源的几丁质酶具有种类多、性质多样、易培养、生产周期短、可操作性强、经济效益良好等优势,因此微生物几丁质酶逐渐成为研究热点[5]。几丁质酶的应用场景大体可分为两类:一是通过降解几丁质生产其他物质及能源;二是通过产生细胞毒性,抑制真菌、昆虫甚至癌细胞等的生长[6-7]。几丁质酶及其降解产物包括GlcNAc低聚物、壳寡糖(chitooligosaccharides,COS)和生物转化产品(如生物燃料、生物电、高值蛋白等),在医药、食品、农业和环境等领域具有很好的应用前景。
然而野生型菌株的几丁质酶产量低、活性弱,直接利用野生型几丁质酶降解几丁质依然存在巨大挑战[8]。近年来有关几丁质酶的研究侧重于蛋白质工程改造、底盘菌株改造等,旨在提升几丁质酶的产量、催化活性以及热稳定性等应用特性。
1 微生物几丁质酶的来源和分类
在自然界环境中,细菌和真菌微生物是几丁质的主要降解者,是几丁质酶重要的资源库[9]。在UniProt数据库(https://www.uniprot.org)中记录的4 378条几丁质酶的相关序列中,存在酶学表征的有932条。这些几丁质酶大部分来自微生物:2 779条来自细菌,236条来自真菌,5条来自病毒,占整个几丁质酶序列的近70%[9]。根据水解位置的不同,可将几丁质酶分为两类:内切几丁质酶(endochitinases,EC 3.2.1.14)和外切几丁质酶(exochitinases,EC 3.2.1.52)(图1)。野生型菌株的几丁质酶产量偏低、活性较弱,在实际应用中的热稳定性也有待提高。近年来关于几丁质酶的工程改造主要针对菌株几丁质酶产量、催化活性以及热稳定性的提高这三个方面[5]。
图1 几丁质酶的作用机制
1.1 微生物几丁质酶的来源
1905年,几丁质酶首次在几丁质芽孢杆菌(Bacillus chitinovrous)中被发现并分离出来[10]。之后,研究人员陆续发现细菌、真菌、病毒等近70种微生物均能分泌几丁质酶,芽孢杆菌[11],粘质沙雷氏菌[12],木霉[13]和拟杆菌[14]等甚至可以产生多种几丁质酶。
几丁质酶存在于不同细菌门类中,如变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)等。水生及土壤环境中的几丁质资源丰富,一些海洋微生物与土壤微生物能够以几丁质为唯一能量来源维持生长,被认为是几丁质酶的重要来源[15-16]。芽孢杆菌属(Bacillus sp.)如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),具有耐高温、快速复活、酶分泌能力强等优点,是目前研究较多的几丁质酶来源微生物。粘质沙雷氏菌是最早被分离出来可以降解几丁质的重要菌种,是研究几丁质酶活性的模式菌[17]。常见几丁质酶的微生物来源如表1所示。
表1 常见几丁质酶的微生物来源
与细菌类似,真菌来源的几丁质酶也具有多样性。几丁质酶在真菌分裂、生长及形态发生过程中起着关键作用,因此不同生长形式的真菌类群分泌的几丁质酶种类差异很大。例如,酵母及具有酵母样生长形式的真菌产生的几丁质酶种类很少,酿酒酵母可以产生两种,白念珠菌可以产生四种,而丝状真菌可以产生10~20种几丁质酶,寄生真菌和昆虫病原真菌甚至可以产生30种或更多种类的几丁质酶[18]。
1.2 微生物几丁质酶的分类
微生物几丁质酶根据作用方式不同,可分为内切几丁质酶和外切几丁质酶。外切几丁质酶按照切割位点又分为几丁质糖苷酶(chitobiosidases,EC 3.2.1.29)和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetyl glucosaminidases,EC 3.2.1.30)(图1),这些都属于糖苷水解酶(glycoside hydrolase,GH)。基于氨基酸序列相似性的糖苷水解酶家族分类方法(carbohydrate-active enzymes database,CAZy)[19],微生物内切几丁质酶主要来源于GH18和GH19糖苷水解酶家族,外切几丁质酶主要来源于GH3、GH18和GH20家族[20]。
内切几丁质酶的主要作用是沿着聚合物在内部随机拆分几丁质, 生成低分子量、 可溶的GlcNAc低聚物[(GlcNAc)n,n≥2][9]。大多数细菌如芽孢杆菌、弧菌、沙雷氏菌产生的几丁质酶都属于GH18家族[21]。GH18家族几丁质酶采用底物辅助保留型催化机制(substrate-assisted retaining catalytic mechanism),催化结构域较为保守,为经典的(β/α)8 TIM桶结构[21]。GH19家族几丁质酶的报道仅限于放线菌、绿非硫细菌和紫细菌以及真菌微孢子门几个类群[22-23]。GH19家族几丁质酶采用单一置换反转型催化机制(single displacement inversion mechanism),具有丰富的α-螺旋结构[22]。
外切几丁质酶可以将(GlcNAc)n进一步裂解为GlcNAc单体。几丁质糖苷酶的主要作用是催化几丁质链的非还原端或催化(GlcNAc)n生成(GlcNAc)2。微生物几丁质糖苷酶大部分属于GH18糖苷水解酶家族。与内切几丁质酶不同的是,几丁质糖苷酶与底物结合区域的空间构造"深且窄",可以更紧密地结合底物,持续发挥催化作用[12]。β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶主要来源于GH3和GH20家族[22],其作用是拆分(GlcNAc)2的β-(1,4)-糖苷键生成GlcNAc单体,且GH20家族来源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶催化活性更优越[24]。
2 微生物几丁质酶的工程改造
从生物经济的角度来看,提升生物催化及生物炼制过程中的催化效率及产品得率,有利于缩短反应时间,节约能源,缩减开支,扩大效益。因此,提升几丁质酶的产量、活性和热稳定性是目前针对微生物来源的几丁质酶及其生产宿主工程改造的重点。
2.1 提高几丁质酶的产量
几丁质酶产量偏低是限制其工业大规模应用的因素之一。提高几丁质酶产量的常用改造方式是对天然宿主菌株进行诱变处理。γ射线介导的物理诱变及甲烷磺酸乙酯(ethyl methyl sulfonate,EMS)和羟基胺(hydroxy amine,HA)联合介导的化学诱变得到的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)及绿色木霉(Trichoderma viride)突变菌株均显示出比野生菌株更高的几丁质酶产量[25-26]。虽然物理诱变和化学诱变都能够提高几丁质酶的产量,但这类方法具有高度不确定性和不稳定性,获得高产菌株的效率比较低。
此外,异源表达也是提高几丁质酶产量的有效策略。常用的微生物细胞工厂包括大肠杆菌(Escherichia coli)[27]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[28]、毕赤酵母(Pichia pastoris)[29]等,这些宿主生长速度快、发酵周期短,具有基因操作系统成熟稳定和重组蛋白分泌能力强等优点。研究人员开发了异源宿主生产几丁质酶系统优化的方法,其经典的优化策略包括信号肽加强蛋白分泌、表达强度优化等[28,30]。
2.2 提升几丁质酶的活性
几丁质酶的催化效率直接影响工业上降解几丁质的成本和效益,因此提升几丁质酶的活性也是微生物几丁质酶工程改造的重点[31]。经典的蛋白质工程倾向于利用蛋白质结构、构象和功能等先验知识,理性改造一个或多个氨基酸残基,从而改进蛋白质的功能。然而,由于对蛋白结构-功能关系理解的局限性,在酶的关键位点进行随机或饱和突变的半理性改造也是常用的酶工程方案。此外,还可以通过在蛋白全序列引入突变的“黑箱”模式定向进化进行工程改造。由此,几丁质酶改造的主要策略分为理性改造、半理性改造及非理性改造(表2)。
表2 几丁质酶催化效率的提升
理性改造包括融合蛋白策略与超声波辅助的构象改变,已经被用于提升几丁质酶的活性[32-33]。几丁质结合位点和催化切割位点是融合蛋白改造的要点,通过替换高效的底物结合域和催化结构域,显著提升了野生型蛋白的催化效率[34-35]。超声波处理的几丁质酶显示出二级蛋白结构的改变,并显著提升酶的活性[32]。半理性改造主要依靠结构指导的定点突变策略[36]。根据分子对接模型预测关键催化氨基酸位点,进行饱和突变以获得催化效率更高的突变体,这是众多来源几丁质酶的统一改造手段[37⇓-39]。非理性改造则侧重于产生具有基因多样性的突变体文库,之后通过筛选得到目标菌株。
整体来看,半理性改造及非理性改造策略对于提升几丁质酶酶活的效果更好(表2)。然而,这两种策略均会产生巨大的样本量,因此采用可靠、灵敏的高通量筛选方式是十分必要的。例如,一种基于雷马唑亮蓝R(Remazol brilliant blue R)染色的胶体几丁质利用了高通量筛选方法[28]。
2.3 提高几丁质酶的热稳定性
热稳定性良好的工业酶有利于降低粘度和污染风险,在生物加工过程中更具优势,因此,热稳定性通常是改善工业用酶催化性能的重要指标。获得热稳定性良好的几丁质酶的最直接的方法是寻求来源于嗜热微生物的耐热酶,将编码耐热蛋白质的基因在工业化水平更高的宿主中克隆和表达是常用的方法[44-45]。利用毕赤酵母细胞翻译后修饰的能力还能够进一步降低发酵后程序的成本[46]。与提高催化活性相似,对几丁质酶的热稳定性改造也包括结构融合与序列设计等理性改造与定点突变等半理性改造[47⇓-49]。这些策略使几丁质酶不仅获得在某个温度更高的稳定性,也获得了更宽容的反应温度,对于生物转化的工业应用具有重要意义。
3 微生物几丁质酶的应用
几丁质酶具有环境友好、经济、安全无毒的特点,在生物转化及生物防控方面具有巨大的应用前景。从底物角度出发,几丁质酶可以降解破坏真菌、昆虫体表或体内的几丁质,发挥防虫、抗菌的作用。从产物角度出发,几丁质酶可以直接催化几丁质生产GlcNAc及其低聚物,也可以在宿主体内进一步转化为其他物质及能源。此外,几丁质酶还能够耐受不同的pH和温度,为其在工业生产方面的应用铺平了道路[50]。
3.1 生物防控
由于几丁质是昆虫肠道(约3%~13%)和角质层(高达干重的40%)的主要成分,这使几丁质酶可以作为一种生物杀虫剂[51]。相比于化学杀虫剂对环境的不利影响,生物杀虫剂具有毒性低、生物可降解、兼容性高等优点,是化学杀虫剂极具潜力的替代品[52]。另外,相比于其他水解生物催化剂(如蛋白酶、葡聚糖酶),几丁质酶也具有突出优势,对不存在几丁质的生物体(如植物、脊椎动物)无害[53]。致病微生物抗性菌株的产生也对化学抑菌剂、杀菌剂产生了一定的挑战。几丁质是病原真菌细胞壁的主要成分,因此几丁质酶被认为是控制真菌病原体的可靠试剂之一。综合以上特性,几丁质酶被认为是潜在的生物防治剂。目前,几丁质酶作为生物防治剂对各种农业常见害虫及植物病原真菌的防治效果已被验证(表3)。此外,对几丁质酶进行纳米修饰能够增强其杀虫作用。例如,修饰纳米级二氧化硅的几丁质酶表现出更高的稳定性和对斜纹夜蛾(Spodoptera litura)更强的杀灭作用[54]。
表3 潜在的几丁质酶生物防治剂
3.2 生物炼制
几丁质酶作为生物催化剂可将几丁质直接降解为COS和GlcNAc[62]。Zhou等[63]研究证实,利用外切几丁质酶与内切几丁质酶联合的方法可以生产COS。GlcNAc可以由来源于Verlicillium CFR2、黄曲霉CFR10和尖孢镰刀菌CFR8的三种不同菌株的几丁质酶联用降解α-几丁质制成[64]。酶解法制备COS和GlcNAc的技术具有成本低、条件温和、预防措施简单和环境友好等优点[65]。COS是潜在的益生元,可被人类结肠中的某些细菌降解,并产生短链脂肪酸等有价值的营养产物[66-67]。GlcNAc在医药方面也有多种应用,包括预防与治疗关节疾病[68],作为黏膜细胞保护剂[69]以及治疗胃肠道疾病等[70]。
一些微生物还能够将几丁质降解得到的碳源、氮源在体内转化为有价值的物质,如动物饲料、氮肥、生物燃料、蛋白质和化妆品等[71]。例如,毛霉(Mucor spp.)具有能够将几丁质粉末转化为生物乙醇的能力[72]。毕赤酵母、粘质沙雷氏菌、酿酒酵母、疣状粘球菌、赭色青霉(Penicillium ochrochloron)中产生的几丁质酶都能够通过水解几丁质生产一种高价值的蛋白质(single cell protein,SCP)[73⇓-75],这种蛋白可被用作替代鱼粉和豆粕的蛋白质来源[76]。
部分土壤微生物及海洋微生物具有胞外电子传递能力,可将几丁质作为电子供体,通过细胞电子呼吸链转化为电能输出。这种将化学能转化为电能的过程需要借助微生物燃料电池(microbial fuel cell,MFC)来实现[77]。例如,电活性微生物Shewanella oneidensis可以通过MFC系统将几丁质转化为电能[78]。同时,电子受体的不同使MFC不仅可以获得电能,而且在生物冶金、环境监测与治理、海水脱盐等众多领域中展现出潜力[79]。
3.3 其他应用
几丁质酶具有良好的抗菌性,因而可将其用于医学治疗感染及食品保存。几丁质酶与抗真菌药物的联用可以治疗各种真菌感染[80]。例如,几丁质酶和乳酸菌的联合给药可以治疗白念珠菌(Candida albicans)感染[81]。Le等[82]证明由Salinivibrio sp.产生的几丁质酶可用于食品保存。
此外,几丁质酶具有很强的抗癌作用。Pan等[83]发现灰链霉菌(Streptomyces griseus)和粘质沙雷氏菌产生的几丁质酶可以破坏小鼠的MCF-7和B11-2癌细胞。Trichoderma Viride AUMC 13021产生的几丁质酶对MCF-7和HCT-116细胞系显示出细胞毒性作用[84]。虽然几丁质酶在小鼠实验中显示出一定的抗癌活性,但是其对哺乳动物肿瘤细胞的细胞毒性及作用机理还需进一步研究。
4 总结与展望
由于微生物几丁质酶适应环境广、生产成本低、热稳定性高、易于工程改造,从而具有广泛的应用空间。在农业领域,价格低廉、无污染的几丁质酶生物防控技术可用于改善环境状况,促进人类健康。在医学领域,几丁质酶不仅具有保护人体免受各种病原体侵害的多种药理活性,而且几丁质酶产生的几丁质衍生物也具有重要的医学价值。在环保领域,几丁质酶能够对海洋废物进行生物催化和生物转化,促进生态友好回收,对海洋生态系统具有积极影响。
几丁质酶在各个领域展现了出极大的发展潜力。如果能够从微生物来源中找到可以抵御各种恶劣条件的几丁质酶,必将增加其在商业方面的应用。在未来的研究中,应该把重点更多地集中在提升几丁质酶的改造效率上。例如,对几丁质酶的理性改造可以利用计算机辅助蛋白设计方法,将对于蛋白质的序列结构、三维特征、催化机制之间关系的清晰认知,与计算机强大的运算能力和先进算法相结合。同时,不断发展的基因编辑工具能够提高产生微生物几丁质酶突变体的频率,为非理性实验设计提供更多的选择空间。目前,由于几丁质酶大规模生产和工业水平的限制,使得几丁质酶发挥的作用十分有限,未来应重点开发这种环境友好、生产稳定的生物催化剂。
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