生命科学
Life science
2023年3月17日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心陈跃军实验室在Cell Press细胞出版社旗下期刊Cell Stem Cell上发表题为“Mapping of clonal lineages across developmental stages in human neural differentiation”的研究论文。该研究通过建立能够跨分化阶段高通量谱系示踪新技术-SISBAR，解析了人多能干细胞定向分化为人中脑多巴胺能神经细胞的单细胞谱系，发现这一过程模拟了人腹侧中后脑神经细胞的发育，揭示了许多新的谱系分化路径和分子调控机制。研究进一步展示了基于SISBAR技术的新发现在改进帕金森症细胞治疗策略中的应用。SISBAR技术有望为干细胞研究带来新的突破。中科院脑智中心博士生游致文和中科院营养健康所博士生王露悦为该文章的共同第一作者，中科院脑智中心陈跃军研究员和中科院营养健康所魏武研究员为共同通讯作者。
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发育与干细胞生物学中的一个基础性问题是如何解析生物体内不同细胞类型之间的发育谱系关系。解析这些谱系关系能够更加深入地解析生命体的正常发育过程以及病理状态（包括癌症与发育障碍）下的分子机制，为操纵在体细胞分化命运，优化体外细胞分化方法，以及促进基于细胞替代疗法的再生医学的发展提供线索。然而，经典的正向谱系追踪和逆向谱系追踪方法，主要用于解析同一个分化/发育时间点不同细胞类型之间的谱系关系，而不能同时提供在上一个阶段与它们有亲缘关系的前体细胞的身份特征。如何持续地追踪细胞在多个分化/发育时间点的细胞状态，从而描绘更完整的细胞发育路径，是发育学领域中亟待解决的问题。
针对以上问题，团队成员通过结合病毒介导的细胞条形码标记技术、单细胞测序技术，以及克隆分离策略，开发了SISBAR技术，并应用在基于人多能干细胞的神经分化模型中。SISBAR技术可以跨分化阶段追踪单个前体细胞衍生的谱系克隆，同时获取该前体细胞的单细胞转录组信息（图A）。团队成员把SISBAR技术应用于人腹侧中后脑的体外分化体系，并建立了“潜能视角”和“起源视角”的谱系分析方法来分别解析由转录组定义的不同细胞类型的分化潜能及分化起源，从而构建了一个多层级的谱系树来描绘整个分化过程（图B）。这一多层级谱系树揭示了中后脑细胞分化过程中许多之前未被报道过的发散型和汇聚型跨阶段谱系分化路径。团队的研究还揭示了跨分化阶段的群体水平谱系和克隆水平谱系之间的关系：在发散型谱系关系中，发现同种类型的前体细胞（单细胞转录组定义的细胞簇）中单个前体细胞的命运可以不同；不同前体细胞差异的分化命运的集合代表了该前体细胞类型在群体水平的分化命运。在汇聚型谱系关系中，发现同种类型子代细胞中的单个细胞可以有不同的谱系起源，并且这些不同来源的子代细胞会带有其亲代细胞独特的基因印迹（图C-D）。
研究团队进一步展示了基于SISBAR技术的跨分化阶段谱系关系和相关分子调控机制的解析在神经系统疾病细胞治疗中的应用。利用SISBAR技术，研究团队发现中脑多巴胺能神经前体细胞具有至少三种命运分化潜能，包括中脑多巴胺能神经元、中脑谷氨酸能神经元、血管软脑膜样细胞（VLMCs）。研究团队还鉴定了早期中脑多巴胺能神经前体细胞的特异性表面分子标记物APCDD1（图E）。将表达APCDD1的神经前体细胞进行流式分选并移植到帕金森病模型小鼠的纹状体后，移植物中目的细胞-中脑多巴胺能神经元的比例得到了显著提高（图F）。并且，与通过SISBAR技术发现的中脑多巴胺能神经前体细胞多分化潜能的结果一致。研究团队在APCDD1分选的移植物中检测到了中脑谷氨酸能神经元和一种血管软脑膜样细胞的存在，这一结果展示了SISBAR技术在改进细胞治疗策略和预测移植细胞体内分化命运中的应用。
本研究工作得到了科技部国家重点基础研究项目，国家自然科学基金委项目、上海市科委项目、跃赛生物创新合作项目的资助。
作者专访
Cell Press细胞出版社公众号特别邀请陈跃军研究员代表团队接受了专访，请他为大家进一步详细解读。
CellPress：
您的团队为何开展本项研究？
陈跃军研究员：
我们研究组主要研究人多能干细胞的神经分化和神经系统疾病的细胞替代治疗。然而，人多能干细胞分化得到的供体细胞（细胞药物）存在显著的异质性，其中包括目的细胞和其他多种类型的非目的细胞。这些非目的细胞的存在不仅降低了细胞药物的治疗效果，还潜在会引起其他的副作用，阻碍了细胞替代疗法在临床上更广泛地应用。为了理解目的细胞和非目的细胞在分化过程中产生的路径和机制，我们开发了跨分化阶段的单克隆谱系追踪新技术—SISBAR。从发育生物学的角度，我们也需要新的技术，在单细胞和单克隆水平对细胞分化和发育的纵向谱系关系进行解析。
CellPress：
您认为本项工作的亮点和重要发现是什么？
陈跃军研究员：
第一，我们建立的SISBAR是一种通用型技术，它能够广泛地应用于包括神经分化在内的基于人多能干细胞的体外分化系统，通过构建整个分化过程的谱系发育树，解析谱系分化的分子调控机制，更好地理解目的细胞和非目的细胞产生的路径和机制，为改进细胞治疗策略，获得更安全稳定的细胞治疗结果，提供重要的底层技术支撑。第二，相比于经典的谱系追踪方法，包括正向谱系追踪（prospective lineage tracing）和逆向谱系追踪（retrospective lineage tracing），其主要解析同一分化时间点不同细胞类型之间的谱系关系，SISBAR可以在单细胞和单克隆水平，跨分化阶段和时间点进行谱系示踪，为理解分化过程中的谱系关系提供了新的视角，是经典谱系追踪方法的重要补充。第三，我们解析了群体水平谱系和克隆水平谱系之间的辩证关系。发现同种类型的前体细胞（单细胞转录组定义的细胞簇）中单个前体细胞的命运可以是不同的，单个前体细胞不同分化命运的集合代表了该前体细胞类型在群体水平的分化命运。这一结果提示，在发育生物学领域，大家认为的发散型分化路径或树状谱系可能只是众多不同的单克隆谱系在群体水平上展现的结果。此外，我们发现中脑多巴胺能神经元的前体细胞还具有另外两种分化潜能—中脑谷氨酸能神经元和一类血管软脑膜样细胞（VLMCs）。这一结果提示，即使我们将100%纯度的中脑多巴胺能神经前体细胞移植到脑内，仍然很难完全去除移植物中的非中脑多巴胺能神经元细胞类型。
CellPress：
您团队在该领域有哪些进一步的计划？
陈跃军研究员：
SISBAR技术中，我们通过单细胞转录组对单细胞的身份和状态进行定义，我们将进一步结合单细胞表观基因组和单细胞代谢组等多组学技术，从多个维度解析对单细胞的身份和状态进行定义，进一步理解谱系分化的机制。我们将开发新的技术，在单细胞和单克隆水平对在体发育过程进行跨发育阶段的谱系示踪，研究在体细胞发育的纵向谱系关系，并比较体外分化谱系和体内发育谱系的异同。
作者简介
陈跃军
研究员
陈跃军现为中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心高级研究员。从事人多能干细胞的神经分化和神经系统疾病的细胞治疗，在Cell Stem Cell、Nature Biotechnology、Journal of Clinical Investigation、Brain、Journal of Cell Biology等国际学术期刊上发表了多篇论文。曾获“国家优秀青年科学基金”、“上海市浦江人才计划”等人才项目资助，曾获教育部自然科学一等奖和教育部自然科学二等奖。
相关论文信息
论文原文刊载于Cell Press细胞出版社旗下
期刊Cell Stem Cell上，
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▌论文标题：
Mapping of clonal lineages across developmental stages in human neural differentiation
▌论文网址：
https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(23)00044-9
▌DOI：
https://doi.org/10.1016/j.stem.2023.02.007
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