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Anal. Chem. - AuPtCo三元合金纳米酶用于化学发光生物分析

科技 06-14 来源：纳米酶Nanozymes

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*本文首发于“纳米酶Nanozymes”公众号，2022年1月15日

*编辑：俞纪元

BRIEF INTRODUCTION

成果简介

化学发光（Chemiluminescence，CL）具有灵敏度高、背景信号低、操作简便等优点，在生物分析领域发挥着重要作用。近年来，纳米酶研究领域的飞速发展为构建新型化学发光催化体系拓展了空间。

青岛大学毕赛教授（通讯作者）、青岛大学附属医院周晓燕博士（第一作者）报道了一种AuPtCo三元合金纳米酶，并应用于化学发光生物分析（图1）。该工作通过一步热还原法制备得到具有Au、Pt、Co三元合金的多面体纳米酶（AuPtCo NPs）。所合成的AuPtCo NPs同时具有类过氧化物酶和过氧化氢酶的催化活性，可催化异鲁米诺（ABEI）-H2O2体系产生“闪光”型化学发光信号。进一步，通过对AuPtCo NPs表面进行生物功能化，赋予催化界面缓慢扩散效应（the slow diffusion effect），产生“辉光”型化学发光信号，从而实现对待测物的灵敏分析。相关成果以“Trimetallic AuPtCo Nanopolyhedrons with Peroxidase- and Catalase-Like Catalytic Activity for Glow-Type Chemiluminescence Bioanalysis”为题发表在国际一流学术期刊Anal. Chem.上。

图1. AuPtCo三元合金纳米酶用于化学发光生物分析

AuPtCo三元合金纳米多面体的合成与表征

作者利用高分子聚合物pluronic f-127作为模板，柠檬酸作为还原剂，采用热还原法制备得到AuPtCo三元合金纳米颗粒（AuPtCo NPs）。SEM（图2A）和TEM（图2B）结果表明，AuPtCo NPs为多面体纳米结构，HRTEM图像（图1B 插图）显示出明显的晶格条纹，d间距为0.235 nm、0.139 nm和0.20 nm，分别对应于立方相的Au（111）面、Pt（220）面和Co（111）面，与XRD结果吻合。Mapping结果（图2C）表明，Au、Pt和Co元素均匀分布在AuPtCo纳米多面体中。此外，采用X射线光电子能谱分析（XPS）对AuPtCo NPs的合金进行了表征和确证（图2D–2I）。

图2. AuPtCo三元合金纳米多面体的表征

AuPtCo的纳米酶性质

作者通过TMB催化显色反应表明，AuPtCo NPs具有类过氧化物酶的催化活性（图3A）。此外，在碱性环境中，AuPtCo NPs可催化H2O2分解，表明其具有类过氧化氢酶的活性（图3C）。利用Michaelis-Menten酶动力学曲线分析得到AuPtCo纳米酶的Km和Vmax值（图3B和图3D）。进一步，通过电子顺磁共振波谱（EPR）验证AuPtCo NPs在催化H2O2分解反应中可产生活性产物HO•、O2•–和1O2。与以往报道的Fe3O4、Pt20和Co3O4等纳米酶相比，该工作所制备的AuPtCo NPs具有优异的类过氧化物酶和过氧化氢酶催化活性。

图3. AuPtCo NPs的类过氧化物酶和过氧化氢酶性质研究

AuPtCo纳米酶催化ABEI-H2O2化学发光反应及反应机理

基于AuPtCo NPs优异的模拟酶性质，其催化ABEI-H2O2反应体系可产生“闪光”型化学发光信号。根据文献报道，纳米材料表面的孔隙或海绵类屏障结构具有扩散-可控效应（the diffusion-controlled effect），可延缓化学发光反应，产生“辉光”型化学发光信号。因此，该工作采用生物分子，如氨基酸、小分子、抗体等作为“屏障”，制备得到生物分子功能化AuPtCo@Bio NPs，利用其催化ABEI-H2O2反应体系，产生“辉光”型化学发光信号（图4A和图4B），并进一步探讨了催化反应机理（图4C）。

图4. 生物功能化AuPtCo NPs（AuPtCo@Bio NPs）催化ABEI-H2O2化学发光反应及反应机理

AuPtCo@Bio纳米酶在化学发光生物分析中的应用

利用半胱氨酸修饰AuPtCo（AuPtCo@Cys）催化ABEI-H2O2化学发光反应体系，实现了对H2O2的快速、灵敏、特异检测（图5A–5C），检测范围为10 nM至5 M，检测限达9.84 nM（图5B）。进一步应用于女性阴道分泌物中H2O2的检测，检测结果与临床采用H2O2试剂盒的检测结果具有较高的一致性（图5D）。

图5. 采用AuPtCo@Cys催化ABEI化学发光反应体系检测H2O2

脂蛋白相关磷脂酶-A2（Lp-PLA2）是一种具有血管特异性的炎症标志物，研究发现Lp-PLA2是冠心病和缺血性卒中的独立危险因素。如图6A所示，该工作将Lp-PLA2作为靶标分子，采用一抗功能化磁性粒子/纳米金（Fe3O4@SiO2/Au/Ab1）作为载体（图6B），利用二抗修饰AuPtCo NPs制备纳米探针（AuPtCo@Ab2），通过夹心型免疫分析法，磁分离后，AuPtCo@Ab2催化ABEI-H2O2化学发光反应，实现对Lp-PLA2的高灵敏、高特异性检测，检测限达0.003 mg/mL（图6C–6E）。进一步将该方法应用于冠心病人血清中Lp-PLA2的检测，检测结果与临床采用比色法的检测结果具有较高的一致性（图6F）。该工作基于生物功能化AuPtCo纳米酶构建化学发光免疫分析法可广泛应用于生物标志物的检测。