第一作者：成卓韦教授（浙江工业大学）

通讯作者：成卓韦教授（浙江工业大学）

论文DOI: doi.org/10.1016/j.efmat.2023.02.001

近日，浙江工业大学成卓韦研究团队在Environmental Functional Materials上发表了题为“Immobilization of the crude enzyme extracted from Stenotrophomonas sp. GYH within modified zeolitic imidazolate framework (ZIF-8-NH₂) and its application in trichloromethane removal”的研究论文(DOI: doi.org/10.1016/j.efmat.2023.02.001)。固定化酶由于其在有限的空间内具有较高的密度，可以提高对某些顽固化合物的去除效率。金属有机骨架（MOF）具有较大的比表面积，内部丰富的孔道结构及易于调节的孔径，具备了作为酶的固定化载体的条件。本研究通过2-氨基苯并咪唑对沸石咪唑骨架-8（ZIF-8）的修饰合成了一种新的材料，并首次用于降解酶的固定化。生物酶提取自三氯甲烷（TCM）降解菌Stenotrophomonas sp. GYH，通过非标记定量蛋白组学进行了鉴定，基于代谢物检测和分子对接，提出了三氯甲烷的降解途径。XRD、BET和FTIR分析表明ZIF-8-NH₂适合作为酶的固定化载体。最佳固定化条件下制备的bio-enzyme@ZIF-8-NH₂与游离酶相比，具有相似的相对酶活性（Michaelis动力学常数Km分别为3.86和3.78 min^-1），但同时拥有更好的pH和温度适应性（pH 5-9和温度10-50°C），更好的储存稳定性（30 d时初始酶活性的83%和40%）等。密度泛函理论（DFT）分析表明，ZIF-8-NH₂载体具有较好的TCM和CO₂吸附位点和吸附能，这与bioenzyme@ZIF-8-NH₂对于三氯甲烷具有良好的去除效率、较少的CO₂排放的实验结果一致。

本研究提取的具有降解性能的粗酶液，主要包括氧化酶、脱氢酶和脱卤酶。基于代谢物检测和计算机模拟，分析鉴定出CCl₃OH、COCl₂、HCOOH和CO₂为主要中间产物。DFT计算表明，ZIF-8-NH₂对CHCl₃和CO₂具有优异的吸附性能。提取的粗酶被固定在新型载体ZIF-8-NH₂内， 获得的Bio-enzyme@ZIF-8-NH₂与游离酶相比，对于三氯甲烷具有更好的降解效果、更低的CO₂释放量，同时具有更好的储存稳定性、可重复使用性、pH稳定性和热稳定性等。本研究为污染环境中三氯甲烷等含氯污染物的治理提供了一种绿色化的环境功能材料，同时也提供了一种新的载体材料用于生物酶的固定化，相信未来将会有更广泛的应用空间。

三氯甲烷（TCM）是氯的消毒副产物，也是一种具有高毒性和持久性的含氯挥发性有机化合物。目前用于去除TCM的处理技术包括吸附法、高级氧化法和热焚烧法；然而，这些技术在应用中常常受到了吸附剂吸附容量、催化剂寿命、二次污染等问题的限制。相比之下，生物法是一种更温和、更绿色的去除技术，但对于含氯等杂原子的化合物，生物法去除往往效果差、时间长等。一些研究表明，直接利用从降解菌中提取的酶可以实现难降解污染物的快速降解。生物酶在接近微生物适宜生长的温度和pH值下可发挥最大作用。与化学催化不同，生物酶促反应产生的产物往往毒性较小。但生物酶的工业化应用潜力也受到其低稳定性（储存、pH和温度）、难以重复使用的限制。固定化技术可以弥补游离酶的不足，并具有明显的优势，例如更高的稳定性、可重复使用性和底物耐受性。MOFs是由特定的有机配体与金属离子或团簇之间的配位形成的多孔有机-无机复合材料。可调节的孔径、表面基团化和高生物相容性使MOFs非常适合作为固定化酶的载体。经过几十年的发展，沸石咪唑酸骨架（ZIFs）在数千种MOF中表现出更好的生物相容性，可在温和的条件下快速合成。一些研究对ZIF材料的表面性质进行了改性，例如引入了一些有机配体，以改善其功能并拓宽其应用。本研究从TCM降解菌中提取生物酶蛋白，并采用改性合成的ZIF-8-NH₂将其固定化。采用非标记定量蛋白组学对提取的酶蛋白进行蛋白质组学分析，并根据检测到的代谢物和可能的降解酶，提出了合适的代谢途径。比较了游离酶和固定化酶的酶特性，包括适应性、稳定性和动力学。采用密度泛函理论（DFT）方法研究了能量变化和结构变化对TCM和CO₂吸附的影响。本研究将提供了一种由生物酶和金属纳米颗粒组成的新型环境功能材料，具有更好的吸附和生物催化性能，即使在某些恶劣条件（例如酸性或高温）下也能保持较好的降解活性。

TCM降解机理分析

Fig. 1. (a) Proper degradation pathway of TCM. (b) Proposed binding mode between the proper intermediates and the selected enzymes. Oxygen, nitrogen, sulfur, carbon, hydrogen, and chlorine atoms are displayed in red, blue, yellow, gray, white, and green, respectively, and hydrogen bonds are represented by dashed lines (yellow)

游离酶降解TCM过程中检测到HCOOH，Cl^-和CO₂。进一步对降解过程中的关键酶进行了非标蛋白组学鉴定，其中39种表现出氧化酶活性（其中14种表现出加氧酶活性），4种表现出卤酸脱卤酶活性，87种表现出脱氢酶活性（包括4种表现出甲酸盐脱氢酶活性）。对中间产物和文献报道的未检测到的HOCCl₃、COCl₂与关键酶进行分子对接模拟，结果显示5种选定的酶可以在形成的口袋位点捕获相应的化学物质（TCM和其他3种可能的代谢物），因此HOCCl₃、COCl₂和HCOOH是粗酶降解产生的最有可能的代谢产物，有力地支持了本研究提出的TCM代谢途径。

材料表征 

Fig. 2. The SEM images of ZIF-8-NH₂ (a) and bio-enzymes@ZIF-8-NH₂ (b); the AFM images of ZIF-8-NH₂(c) and bio-enzymes@ZIF-8-NH₂(d); XRD spectra (e) and FTIR spectra (f) of ZIF-8, ZIF-8-NH₂, and bio-enzymes@ZIF-8-NH₂; Sorption simulation adsorption model (g) and possible adsorption points (h) of the carrier material ZIF-8-NH₂ for CHCl₃

载体材料ZIF-8-NH₂接近四边形金字塔结构，尺寸约为500nm，氨基的引入使得ZIF-8具有更粗糙的晶体形态（图2a,，c）。酶蛋白的交联负载也显著改变了ZIF-8-NH₂的表面形貌。与ZIF-8-NH₂相比，固定化酶的结构（图2b，d）更接近ZIF-8的常规十二面体结构，晶体尺寸约为150 nm，表面更光滑。元素分析表明酶蛋白的固定化导致Bio-enzyme@ZIF-8-NH₂材料中P和O的含量显著增加。XRD证明氨基引入不会改变ZIF-8的晶体结构，而酶蛋白交联后，XRD峰强度降低，可能是由于酶与ZIF-8-NH₂上的Zn位点的结合较强。FTIR表明酶蛋白成功固定在ZIF-8-NH₂材料中。BET实验表明ZIF-8-NH₂和bio-enzymes@ZIF-8-NH₂的吸附等温线均为H1型滞后回路的IV型等温线，酶蛋白的交联负载扩大了ZIF-8-NH₂的孔径，但导致其比表面积减小。DFT计算表明，载体材料可以自发实现TCM分子的富集，为后续的生物酶降解提供更好的条件。

固定化参数对bio-enzymes@ZIF-8-NH₂降解能力的影响

Fig. 3. Effects of immobilized conditions on the relative activity and enzyme immobilization efficiency of bio-enzymes@ZIF-8-NH₂. (a) glutaraldehyde concentrations; (b) crosslinking time; (c) immobilization time; (d) loading of enzyme; (e) molar ratios of two organic ligands; (f) molar ratios of zinc ion to the organic ligand

分别对交联剂浓度、交联时间、固定化时间、酶负载量、有机配体比例和锌离子与有机配体摩尔比等固定化参数进行了考察，探究它们对酶固定化效率和酶活的影响。结果表明，当戊二醛浓度为1%、交联时间20min、固定化时间90min、负载酶量10mg、有机配体比例19：1、锌离子与有机配体的比例为1：20时，酶的固定化效率达到最大值，酶活性维持较好。

游离酶与固定化酶的特性对比 

Fig. 4. Comparison of the adaptability to temperature (a) and pH (b) of the free and immobilized enzymes

Fig. 5. (a) Storage stability of the free enzymes and bio-enzymes@ZIF-8-NH₂ and (b) the reusability of bio-enzymes@ZIF-8-NH₂

Bio-enzymes@ZIF-8-NH₂在10-50 °C温度范围内表现出良好的酶活性，而游离酶在40 °C时明显失去活性。 此外，在30 °C的最佳温度下，Bio-enzymes@ZIF-8-NH₂的相对酶活性高于游离酶。Bio-enzymes@ZIF-8-NH₂在不同pH体系中表现出比游离酶更好的相对催化活性。酶动力学分析表明固定化酶的V_max值为23.3645 mg L^-1 min^-1，是游离酶的1.2倍。Bio-enzyme@ZIF-8-NH₂在室温储存30天后保留了83%的相对酶活，而游离酶的相对酶活仅保持了40%，重复使用实验表明固定化酶重复使用性较好。

固定化酶降解TCM过程中C和Cl的质量平衡

Fig. 6. (a) The amount variation of TCM and its main metabolites during TCM metabolization by bio-enzymes@ZIF-8-NH₂; (b) comparison of the carbon mass during TCM degradation by free enzymes and bio-enzymes@ZIF-8-NH₂; and (c) CO₂ adsorption characteristics of ZIF-8-NH₂ and enzyme@ZIF-8-NH₂

Bio-enzymes@ZIF-8-NH₂在200 min内可完全转化596.5 μg的TCM。TCM所含的碳约100%的C转化为HCOOH和CO₂中含有的C，所含Cl全部转化为Cl^-，整个过程中并未检测到二氧化碳。碳平衡分析表明载体材料可以吸附产生的CO₂。对bio-enzyme@ZIF-8-NH₂进行了吸脱附试验。如图6c，ZIF-8-NH₂和bio-enzyme@ZIF-8-NH₂的饱和CO₂吸附容量分别为9.4和3.5 cm³ g^-1，表明载体和固定化酶对于CO₂具有吸附能力。DFT计算也验证了这一结果。

本研究所制备的bioenzyme@ZIF-8-NH₂既具有良好的污染物降解能力，又具有良好的CO₂吸附功能，这意味着可以通过生物降解这一绿色低碳处理技术去除污染物，最终实现CO₂零排放。未来需要进一步的研究来确定材料合成条件对CO₂捕获的影响，并实现材料的结构操纵，以实现有效的气体选择性分离。制备的Bioenzyme@ZIF-8-NH₂具有水稳定的特点，因为疏水氨基的引入降低了水分子接近晶格并攻击框架结构的可能性，因此也可用于自然水体中污染物的治理。

成卓韦 教授、博士生导师，浙江工业大学环境学院院长助理。主持国家重点研发计划子课题2项、国家自然科学基金2项等国家级及省部级项目10余项。已在包括环境领域顶级期刊Environmental Science & Technology、国内知名期刊中国科学B化学等在内的本领域权威期刊上发表学术论文70余篇，累计被引用800余次，ESI高被引论文2篇，封面论文1篇。授权发明专利20余项，其中美国等国际专利2项，出版教材3部，主持或参与团体标准4项。曾入选浙江省“育才工程”，获中国石油和化学工业联合会科学技术进步奖二等奖1项（排名1/8）、获教育部高等学校科学研究优秀成果奖科学技术进步奖一等奖（排名6/12）、中华环保联合会自然科学奖特等奖（排名3/7）和中国商业联合会科学技术进步奖特等奖（排名3/10）各1项。荣获第五届浙江省环境科学学会青年科技奖。

备注: Permissions for reuse of all Figures have been obtained from the original publisher. Copyright 2022, Elsevier Inc.

参考文献：Z.W. Cheng, Z.R. Sun. Immobilization of the crude enzyme extracted from Stenotrophomonas sp. GYH within modified zeolitic imidazolate framework (ZIF-8-NH2) and its application in trichloromethane removal. Environmental Functional Materials 2022,          

文章链接: https://doi.org/10.1016/j.efmat.2023.02.001