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在本项研究中，研究人员利用果蝇蛹期肠道作为独特的研究模型，解决组织器官中干细胞数目决定问题。果蝇蛹期肠道干细胞（pISC）在成蛹后44小时开始发生不对称分裂，形成位于顶端的肠道干细胞祖细胞（ISCP）以及位于基底的内分泌细胞母细胞（EMC）。ISCP与EMC将各自进行一次对称分裂，分别形成一对成虫肠道干细胞（ISC）以及一对肠道内分泌细胞（ee）（图1，wildtype）。所谓的不对称分裂，即在有丝分裂过程中，细胞极性蛋白Bazooka/Par3，定位于干细胞的顶部细胞膜，与Par复合体的Par-6和aPKC共同作用，将Miranda（Mira）蛋白推至基底细胞膜上。Mira是一个可以与多种蛋白发生物理结合的关键因子，它将ee细胞分化的关键转录因子Prospero（Pros）从干细胞的细胞质中拉到其位于基底的细胞膜，从而使得在干细胞分裂之后，仅有基底子代细胞可以获得Pros，使其进行向ee细胞分化（图1，wildtype）。

鉴于Notch信号通路在pISC维持与分化中的重要作用，研究人员首先检测了Notch突变条件下干细胞的谱系形成过程。通过搭建的显微实时成像系统，研究人员首次发现Notch突变的pISC仍然进行的是顶端-基底不对称分裂，形成了ISCP与EMC。然而，本该在ISCP中不再表达的Pros，在Notch突变的情形下继续转录、翻译，使得ISCP又一次不对称分裂，形成一个Pre-ee和一个ee（图2）。随着发育的进展，Notch突变的Pre-ee在果蝇出蛹前也成为了Pros⁺的ee细胞。最终Notch突变的pISC谱系形成4个ee细胞（图1，Notch^-/-）。这些结果说明，Notch的作用是在不对称分裂后的顶端子代细胞中抑制Pros的转录，从而使得顶端子代细胞在将来成为肠道干细胞。

那么为什么Notch信号通路仅在顶端的子代细胞中激活呢？在过去三十年的果蝇神经干细胞（Neuroblast, NB）和感觉器官前体细胞（Sensory Organ Precursor, SOP）的不对称分裂研究中，大家普遍认为是由于Numb，这个Notch降解相关蛋白，在不对称分裂中定位到基底细胞中造成的。然而，研究者发现，Numb在pISC中的突变并不会改变Notch信号在pISC谱系中的激活，这提示有还未揭示的机制造成了Notch的不对称激活。

由于Notch并未影响pISC中极性的形成，那么果蝇肠道中干细胞的数目是否是由不对称分布的极性蛋白决定的呢？于是研究者在pISC谱系中过表达了Mira蛋白，并推测由于顶端-基底极性的存在，过表达Mira将导致位于基底的子代细胞不断进行不对称分裂，在肠道中形成过度增殖的pISC细胞团。然而出乎意料的是，过表达Mira仅使得干细胞在肠道中数目加倍。经过细致的谱系追踪分析，研究者发现过表达Mira使得本该成为EMC的基底子代细胞成为了肠道干细胞样（ISC-like）的细胞。在顶端的ISCP发育成2个ISC，加上ISC-like细胞产生的2个ISC与2个ee，最终形成了6个细胞的pISC谱系（图1，>mira）。而之所以>mira pISC谱系中的EMC无法再次成为ISC-like的原因为：此EMC中顶端-基底的细胞极性消失，细胞分裂轴向随机产生，不能再次为Mira-Pros蛋白复合体指导不对称分布，从而在有Mira的表达情况下产生了一对ee细胞（图1，>mira）。这提示pISC的顶端-基底极性只能维持2轮细胞有丝分裂。

在获得Mira的过表达结果后，研究人员认为mira的突变应该使得pISC的第一次有丝分裂就变成对称分裂，Pros对称分布到两个子代细胞中，使得肠道中ISC丢失。然而出乎意料的是，突变mira获得了与过表达Mira相同的表型：肠道中干细胞数目增加了一倍。原本应分化成EMC的基底子代细胞在mira突变的情况下又变为了ISC-like细胞。带着疑问，研究人员利用显微实时成像，发现mira突变的pISC发生的确实是Pros对称分裂。然而，在分裂发生之后，位于顶端的子代细胞中Pros表达量下降，位于基底子代细胞中的Pros量上升。顶端的子代细胞成为ISCP，而基底子代细胞成为ISC-like细胞（图1，mira^-/-）。

视频显示，mira突变后分布到基底子代细胞中的Pros量减少。这是由于在缺失Mira后，Pros的对称分裂减少了本应该仅进入基底子代细胞中的Pros蛋白量。于是研究人员在不同基因背景下，在细胞分裂时/分裂后，在pISC以及子代细胞中对Pros进行染色的定量分析。发现如果将pISC进行有丝分裂中期的Pros蛋白量定为100，那么基底细胞在有丝分裂完成时，细胞核中的Pros蛋白量要平均超过143，此时的基底细胞才会成为EMC，产生2个ee细胞。否则该基底细胞将会成为ISC-like细胞。这一机制同样适用于>mira，因为pISC的基底细胞膜无法承载过量表达的Mira，相当一部分的Mira结合了Pros，进入了顶端子代细胞中，造成了基底子代细胞中Pros蛋白量的减少（图1，>mira）。

那么，为何进入了顶端子代细胞中的Pros无法使得ISCP成为ISC-like或者EMC？研究人员发现极性蛋白Baz总是位于顶端子代细胞中，如果将Baz与Pros的量对比来看，只要Baz的蛋白量与Pros的量大于一个比值，则该细胞就一定会成为ISCP。那么该比值背后的分子机制是什么呢？Baz的突变表型为pISC谱系中无法产生Notch的激活，所有的子代细胞全部分化为ee（图1，baz^-/-）。这提示很有可能是Baz促进了顶端子代细胞中Notch的激活，从而抑制了Pros的表达。至此，研究人员重新回到了最开始的问题，将Notch信号通路与细胞极性联系了起来。

为了进一步证明上述的猜想，研究人员突变了Par复合体中的Par-6与aPKC。研究人员认为，与Baz属于同一Par蛋白复合体中的Par-6与aPKC的表型应该与Baz突变一致，pISC的子代细胞无法激活Notch，全部分化为ee细胞。然而出乎意料的是，Par-6与aPKC的突变表型与>mira和mira^-/-一致，均为干细胞数目加倍的表型（图1，Par6^-/- or aPKC^-/-）。经过进一步研究，研究人员发现Baz突变使得Par-6与aPKC无法发挥功能，但是Par-6与aPKC的突变不改变Baz的定位，此时Baz仍然可以激活位于顶端的子代细胞中的Notch，维持ISC的命运不受改变。这些结果再一次提示Baz在顶端细胞的定位，是ISC有丝分裂之后产生不对称Notch激活的原因。

通过完备的遗传互作实验，研究者证明了pISC谱系中Notch的激活是由于Baz在顶端子代细胞中的定位产生的。此外，研究者还发现，在pISC完成不对称分裂之后，Baz特异定位在了两个子代细胞所接触的位置（图3），并且，Notch受体的染色存在与Baz共定位的现象（图3）。于是研究者提出Baz可能通过将Notch定位至顶端细胞与基底细胞相接触的界面，介导了Notch不对称激活的产生。

最后一个关于细胞极性与pISC谱系形成的问题是：Mira为何在pISC中表达，介导细胞的不对称分裂，然而在基底子代细胞中其表达就消失了？早在2006年，Andrea H. Brand研究组就提出，Pros可以直接与mira的转录调控区结合，抑制mira的转录。然而在上述的遗传操作中，达不到Pros阈值的基底子代细胞中Mira都是正常表达的，没有被Pros所抑制，这是为什么呢？研究者采用了果蝇Fucci细胞周期可视报告系统，结合细胞周期停滞实验，发现Pros的转录翻译从pISC G1期就已经开始，而Mira的表达直到G2期才开始转录。没有达到阈值的Pros蛋白量无法抑制mira的表达，而Mira一旦表达出来，即会结合Pros将其拉至基底细胞膜，抑制Pros对其自身的转录抑制。因此G2后期的Pros即使超过阈值，也无法对mira的转录产生影响，直至不对称分裂发生后，超过阈值的Pros在新的基底子代细胞中完全抑制mira的转录。

综上所述，该项工作通过遗传和细胞生物学实验，提出了果蝇蛹期肠道发育过程中干细胞数目与谱系决定的四项基本原则（图4A）。在干细胞微环境理论之外，证明了干细胞内部的细胞极性分子通过调控转录因子的阈值，可以精确地控制干细胞的数目。此外，该项研究揭示了pISC的谱系与SOP谱系存在Notch信号激活和谱系形成之间的巨大相似性，结合该研究组之前的工作，pISC的不对称分裂是一种介于NB和SOP之间的状态，将对不对称分裂的深入理解起到桥梁作用。