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《三国演义》里有追杀“红袍曹贼”的情节：

（图片来源：《三国演义》电视剧）

但是如果有很多人都穿着红袍，你还能分得清追杀对象吗？

这不是搞笑段子，科学家在研究细菌时也碰到了这样的问题，他们是怎么解决的？

植物根部有密密麻麻的细菌，这些根部细菌和植物的生长生活息息相关，而它们之间的关系也十分精彩，简直就是一出“微观三国”。

例如荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）能形成生物膜保住水分，帮助植物抵御干旱；荧光假单胞菌还能产生多种抗生素杀死周围其它的细菌独享地盘；一些细菌的代谢产物是其它细菌的食物，其它细菌的代谢产物又是这些细菌的食物，不同细菌之间“互相喂食”形成“利益共同体”……

但是如果我要细致问：这些根部细菌有多少种？它们谁和谁是好朋友？谁和谁是敌人呢？这些细菌在植物根上是均匀分散，还是某些细菌关系很好、会住在一起呢？

你不知道了吧，而且你甚至不知道什么样的研究方法能得到这些问题的答案。

插画：密密麻麻的不同细菌生活在一起（图片由AI绘制）

目前科学家研究植物根部微生物的常见方法，是将植物根部微生物冲洗下来收集到一起，然后对这些混杂的细菌进行DNA测序，通过DNA信息判断其中包含多少种细菌以及各种细菌的比例。

方法很方便，但是细菌被冲洗下来的一瞬间就丢失了在根部生长的位置信息，就像你把居民楼里所有人都叫下来确实能最快地统计出人数，但是看着乱哄哄的人群无法知道谁谁谁原来住在哪间房。

如上文提到的荧光假单胞菌和枯草芽孢杆菌原本是紧密生长在一起的，可是一旦脱离根部、和其它细菌混在一起，就再也无法通过“这两种细菌总是生长在一起”来帮助判断细菌之间的关系了。

所以：如果有一种方法，既能统计细菌的种类，又不会丢失位置信息，那就太好了！

其实方法也不是没有，叫做“荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）”。简单来说是这样，每种细菌会转录出数量非常多的rRNA分子，每种细菌的rRNA都是不同的，就像细菌的身份证能用来区分不同细菌。

科学家设计合成了一段DNA叫做探针，探针可以和细菌的rRNA特异性结合，也就是一种探针只结合一种细菌的rRNA。针对芽孢杆菌的探针只能结合芽孢杆菌，大肠杆菌的探针只能结合大肠杆菌。探针与目标RNA的精准匹配、严丝合缝，简直就像是：一把钥匙一把锁，手机贴上手机膜，下水道上盖了盖，王八钻进王八壳。

拼图碎片和DNA探针的共同点在于：都能严丝合缝地匹配到应该结合的地方

细菌的rRNA和探针都非常小，如何能被我们观察到呢？

科学家会在不同类型的探针末尾绑定上不同颜色的荧光基团。由于一个细菌内部会转录出大量的rRNA，因此能结合上非常多的探针和荧光基团。单个探针上的荧光不一定能被观察到，但是超大量的荧光基团汇聚在一起“微火聚光”，就足以“点亮”这个细菌。从太空中你看不到一只手电筒的光，但能看到整个城市的万家灯火。

假设探针A能只和枯草芽孢杆菌接合，并且只有探针A尾部带了红色荧光基团，那么我们让探针A去和植物的根部接触，但凡有枯草芽孢杆菌的地方，探针A就会结合上去发出红色荧光。我们也可以反过来说，有红色荧光的地方就有枯草芽孢杆菌，红色荧光越多说明这种细菌多。

一种探针只结合一种细菌的rRNA

科学家让不同的探针带不同的颜色，这样可以使得每一种颜色就能标记一种细菌（比如让芽孢杆菌发红光、大肠杆菌发绿光……），最终通过不同颜色标记出植物根部细菌的种类和数量。这就是传统的荧光原位杂交技术通过颜色来区分不同细菌的原理。

拟南芥叶片微生物FISH成像

FISH成像小麦根上的微生物

但是，这里面有个巨大的缺陷：根部的细菌种类千千万，荧光基团的颜色却少得可怜，红、黄、蓝、绿等寥寥几种就没得用了。荧光基团少，就意味着只能标记少数几种细菌，而植物根部的细菌动辄百十上千种，只靠三五种颜色实在是很难，这样的身份证发不了几张……

还记得文章开头的“追杀曹贼”故事吗？聪明的你应该已经想到了：用不同的颜色组合就可以解决问题！（比如“穿红袍绿裤黄帽黑鞋的是曹贼！”）

利用颜色的组合，科学家发明了一种能在微米尺度下同时观测上百种细菌的位置、数量和相互作用的新技术。

接下来让我们看一下这项技术具体是怎么工作的。

首先为了克服荧光种类不足的问题，戴磊老师团队放弃“一种颜色对应一种细菌”的检测方法，而是用多条带不同颜色的探针按顺序结合细菌，荧光基团发光顺序的组合代替某一种颜色。

原理示意图

举个例子（下方视频），研究团队先让第一条探针结合细菌的rRNA，记录第一条探针结合后的颜色（红色），洗去第一条探针；让第二条探针结合，记录第二条探针结合后的颜色（绿色），洗去第二条探针；再结合第三条；以此类推让八条探针依次结合，记录八种颜色连起来的顺序“红绿绿黄红蓝…”，对着之前设计好的编码顺序一找，红绿绿黄红蓝这个顺序对应XXX细菌…”

八种探针依次结合并且释放荧光

这么做的好处是显而易见的。

首先：荧光组合千变万化，可以标记的细菌种类远超单一的荧光颜色。这就好比，我在大街上等网约车，司机电话说“我的车是红色的！”那你一定会头疼，因为大街上车太多颜色太少总有好多辆红色车同时出现，但是可以给每辆车安排一个车牌号，这样就可以对每一辆车一个独一无二的编码。

其次，探针的结合正确率不是100%，万一有的探针发光错误或者压根不发光，岂不是会错认成其它细菌，或者检测不出这是什么菌么？为了解决这个问题，团队使用的探针的序列是经过特殊编码的，保证了错读或者丢失个别荧光仍能识别准确。

我们仍使用车牌号来比喻，如果我规定出租车的车牌号所有数字必须在0-5之间，网约车的车牌号的数字必须在6-9之间，那么我在大街上看到一个车牌号是“2274”，很明显车牌写错了，但我可以肯定这辆车更应该是出租车而不是网约车，因为四个数字里面有三个都在0-5之间。

也就是说，如果一个出租车的车牌变成“2274”，只需要变动一个数字；而网约车的车牌变成“2274”则需要其中的“2、2、4”都写错，同时写错三个数的概率太小了。而且，即使车牌号丢失一位，我也可以通过剩余的其它数字判断这是什么车。

同样的道理，团队设计的探针荧光的组合是经过特殊编码的，一种荧光组合和另一种荧光组合之间差异很大。即使其中一两个探针结合错误发错了光，或者没有结合上没有荧光，并不会让你错误地匹配到其它细菌的荧光组合上，依然可以通过剩下几条探针的荧光去判断这个细菌是什么。

SEER-FISH工作原理

像这样一种颜色组合改变成另一种颜色组合需要改变的字符的数量，就被称作汉明距离，汉明距离越大就是一个字符串需要改变更多字符才能变成另一串字符。

看这个汉明距离很近的组合，改变一种颜色就改变了结果：

而团队设计的探针和探针之间，汉明距离很大，因此其中一两条探针出错不会影响判断的结果：

开发出SEER-FISH技术后，戴磊老师团队立即开展了测试。团队使用新技术对合成微生物群落（也就是人为组合的微生物群落，其中的微生物种类和比例是已知的）进行了检测。

在不同的测试中得到的群落物种组成高度一致，改变其中4种物种的丰度，SEER-FISH也能准确发现该物种的比例发生了变化。进一步，在更复杂的微生物群落中使用不同编码方案也得到了一致的结果，达到对群落物种80%以上的识别率。这些结果说明它检测不同微生物非常准确和有效。

两种不同的编码方式，都能准确反映微生物群落的组成结构（图中每一个荧光点就是一个细菌）

那么SEER-FISH能解决文章开头提出的反映细菌空间位置的难题吗？研究团队又使用它直接在拟南芥（科研中常见的模式植物）的根部进行微生物群的空间成像，发现微生物在植物的根尖“物以类聚，菌以群分”，有聚集倾向而非随机的零散分布。一些聚集体中还存在多个物种。分析群落中微生物的空间邻近关系，发现了有些菌-菌之间存在明显的空间关联。

由于根系微生物可能和植物存在互动，因此研究团队进一步对根系微生物施加了植物代谢物植保素（camalexin）和香豆素（fraxetin）扰动，用来观察添加植物分泌代谢物的情况下微生物活动的变化。

团队发现施加化学物质扰动后，根系微生物的组成和空间分布都发生了改变。比如中华根瘤菌原先主要定植于靠近根尖的位置，加入植保素和香豆素后定植位置发生了改变。农杆菌本身居无定所，但在受到香豆素扰动后，更多集中出现在根成熟区。

这说明这一新技术能有效地帮助研究植物根部微生物之间的空间关联，帮助研究复杂微生物群落生态的机制。

SEER-FISH在实验中有不俗表现，但研究团队不满足于此，提出了更多的改进措施：

希望未来能早日看到升级版本的SEER-FISH，发现更多微生物群落生态的机制，帮助我们更好地了解这个世界、造福人类。

（本文图片除说明来源者之外，均由作者提供） 

作者：张浩

作者单位：中国科学院深圳先进技术研究院