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引用本文：杨宇帆, 赵亚玲, 王曦, 等. 成纤维生长因子受体1基因剪接突变导致卡尔曼综合征1例 [J] . 中华医学杂志, 2023, 103(8) : 605-607. DOI: 10.3760/cma.j.cn112137-20220728-01645.
通信作者：茅江峰，中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院内分泌科，北京100730，Email：maojiangfeng88@sina.com.
摘要
本文报道1例29岁患者的临床表现、生化检验、影像学资料，以及患者父母的临床表现进行分析成纤维生长因子受体1（FGFR1）基因失活突变导致卡尔曼综合征（KS）患者的致病基因和临床特点，增加对此疾病发病机制的认识。抽取患者及其父母外周静脉血，提取基因组DNA，同时提取患者和父亲血mRNA，逆转录为cDNA后行二代测序。分析患者与父亲表型不同的原因。结果显示（1）根据患者临床表现和促性腺激素、睾酮水平降低的实验室检查结果，确诊KS，患者父母均正常；（2）患者FGFR1存在剪接位点突变（c.359-1G>A），突变来自父亲，但父亲性腺轴功能正常，突变为首次报道；（3）患者FGFR1转录本缺失第4外显子，而患者父亲FGFR1转录本正常；（4）促性腺激素释放激素（GnRHa）脉冲治疗效果好，用药后有精子产生。总之，FGFR1基因剪接位点突变导致KS，文献罕有报道。现将诊治经过报道如下。
本文报道的1例“卡尔曼综合征（Kallmann syndrome，KS）”［1-2］伴皮肤鱼鳞病患者，为来自北京协和医院内分泌科收治的29岁男性患者和其父母。患者根据无青春发育和嗅觉丧失的病史、小阴茎和隐睾的查体以及实验室检查结果，诊断为“KS伴鱼鳞病”。患者父母根据青春发育情况及婚育史，判断其性腺轴功能正常。签署知情同意书后，抽取外周血，提取基因组DNA进行二代测序分析，本研究通过医院伦理委员会审批（编号JS-2111）。现将诊治经过报道如下。
1. 实验室化验和影像学检查：实验室检查和影像学检查分别由北京协和医院检验科和放射科完成。
2. 基因组DNA提取：按照操作说明书，提取患者及父母外周血白细胞DNA，进行二代测序。
3. 测序：按照操作说明书，使用高通量测序系统 Illumina Nextseq 500对产物进行测序。
4. 测序结果分析：二代测序的基因panel包含先天性低促性腺激素性性腺功能减退症（CHH）相关的基因97个。测序结果分析时，参考基因组版本为GRCh37/hg19，并参考千人基因组、NHLBI 外显子组测序项目（ESP6500）、外显子组聚集联盟（EXAC）和EXAC-EAS（EXAC约4 000个东亚人）的数据库。将致病基因的测序结果，与NCBI网站数据库进行比对分析（GenBank编号FGFR1），并与人类基因突变数据库（HGMD）进行比对。
5.突变验证：针对检测出的变异位点设计特异引物，进行Sanger测序，采用 ABI3730xl DNA 测序仪进行双端测序。对于c.359-1G>A突变，正向引物为CTTCCTCCCCTTTCAGCCTT，反向引物为GAAGCAAACACGCACAGGAA。
6.临床检查：患者出生时为男性外阴，阴茎长1 cm，阴囊发育差，右侧隐睾，嗅觉丧失。随着年龄增加，阴茎无明显增大，无阴毛增长。在 22岁时，外院根据上述临床表现和化验结果，诊断“CHH”，开始口服十一酸睾酮治疗14个月。用药后阴茎有增长。在24岁开始绒毛膜促性腺激素和尿促性腺激素（HCG+HMG）生精治疗3年。过程中睾丸体积增加到L/R=2/0 ml，但未能诱导精子生成。目前患者29岁，已婚5年，有性生活，有射精，未生育。
患者父母非近亲婚配，否认类似遗传病史。父母青春发育正常。父亲31岁结婚，有正常性生活。其婚后6个月爱人怀孕。
患者腹型肥胖，身高180 cm，体重90 kg。双上肢轻度鱼鳞样皮肤，阴茎长度3 cm，周径4 cm，阴毛P5。左侧睾丸体积2ml。右侧隐睾。乳房B1。
7. 辅助检查：血促黄体生成激素（LH）0 U/L（正常1.5~9.3 U/L），促卵泡生成素（FSH）0 U/L（正常1.4~18.1 U/L），曲普瑞林兴奋试验后60 min，LH和FSH分别升到 0.4 U/L和1.2 U/L。雌二醇 22.6 ng/L（正常 19.9-47.9 ng/L），睾酮 0.2 μg/L↓（正常3.8~6.8 μg/L）。促肾上腺皮质激素（ACTH）39.8 ng/L（正常0~46 ng/L），血总皮质醇237 μg/L（正常40~223 μg/L）。其他垂体前叶激素水平和生化检查未见异常。嗅神经MRI示双侧嗅球、嗅束未发育（图1A）。
图1 患者嗅球MRI检查及基因测序结果
A：嗅球MRI中箭头所指显示嗅球发育不良；B：成纤维生长因子受体1基因剪接位点发生杂合突变。上、中、下的碱基序列，分别代表患者、父亲和母亲。箭头所示为碱基突变 c.359-1G➝A。突变来源于父亲
8. 诊治和随访：根据临床表现和生化检测，诊断“KS伴鱼鳞病”。患者有生育需要，给予脉冲促性腺激素释放激素（GnRH）治疗：戈纳瑞林8 μg/90 min。治疗6个月后复诊：勃起次数增多，性生活改善，有射精。睾丸体积L/R=5/0 ml。测定LH 8.5 U/L，FSH 13.6 U/L，碘 3.04 μg/L。精液检查见大量精子，精子浓度1 280万/ml。
9. 突变位点功能预测：患者成纤维生长因子受体（FGFR1）基因存在c.359-1G>A的剪接位点突变。c.359-1G>A位于第3内含子和第4外显子交界处，来源于父亲（图1B）。该突变会引起mRNA剪切异常。文献数据库中无该位点突变（图2A）报道。根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南［3］，此剪切突变为低频突变，符合PVS1+PM2，判定为疑似致病性变异。
图2 成纤维生长因子受体1（FGFR1）基因剪接突变结构与影响示意图和蛋白三维预测模型
A：患者FGFR1基因剪接位点突变示意图；B：FGFR1基因剪切突变影响示意图；C：正常FGFR1受体蛋白模型；D：由于剪切异常，第四外显子丢失后形成791个碱基合成的新蛋白质的预测模型
用Splice Site Score Calculation软件预测，该突变的剪切分数为-0.5，远小于正常值10.5。SPIDX软件预测分数为-18.860 2（绝对值>2即影响剪接）。REVEL软件的突变预测分数为0.424，提示为潜在有害。上述多个功能预测软件的结果均提示，该位点无法进行正常剪切，可能导致第4外显子缺失（图2B）。与此相应，三维结构蛋白质模型显示突变后的蛋白结构和正常结构相比差异甚大（图2C、D）
10. FGFR1基因剪接突变的致病机制：FGFR1基因突变导致CHH为常染色体显性遗传。患者FGFR1基因c.359-1G>A突变来源父亲。但父亲的生殖表型正常。为了进一步分析患者与父亲表型不同的原因，研究该位点的致病机制。提取患者和父亲血中mRNA，逆转录为cDNA，对产物行二代测序。通过与正常FGFR1基因转录本比较，发现患者缺少第4外显子（ATGCTCTCCCCTCCTCGGAGGATGATGATGATGATGATGACTCCTCTTCAGAGGAGAAAGAAACAGATAACACCAAACCAAACC）的转录（图3A）。FGFR1基因第4外显子丢失，导致翻译后蛋白减少31个氨基酸（DALPSSEDDDDDDDSS SEEKETDNTKPNRMP），三维结构发生巨大的变化（图2D）。患者父亲转录本正常，无FGFR1第4外显子缺失（图3B）。二代测序未检测到其他和CHH或性发育异常相关的基因突变。
图3 患者与父亲mRNA逆转录产物测序结果
A：患者mRNA逆转录产物测序结果异常，红框表示缺失第4外显子；B：患者父亲mRNA逆转录产物测序结果正常，没有第4外显子缺失
讨论
本例患者以“小阴茎、青春不发育和嗅觉缺失”为突出表现。生化检查提示促性腺激素和睾酮水平明显降低。基因检测证实FGFR1基因存在剪接位点突变（c.359-1G>A），mRNA验证存在FGFR1第4外显子缺失。因此诊断“FGFR1基因失活突变致KS”明确。CHH是一类由多种基因突变导致下丘脑GnRH神经元数量减少，男性患者主要表现为青春期不发育及生精障碍，发病率为1/8 000~1/10 000［1, 2］。伴随嗅觉丧失的CHH，又被称为KS。
FGFR1蛋白由822个氨基酸组成，在体内广泛表达。FGFR1蛋白分为胞外区、跨膜螺旋区和具有酪氨酸活性的胞内区。胞外区包含3个免疫球蛋白样折叠，分别称作D1、D2和D3。在D1和D2的连接处有连续的酸性残基（酸盒），后续是D2和D3的结构域［4］。
FGFR1基因突变可导致各种疾病发生。失活突变则导致CHH，表现为小阴茎，睾丸体积小，嗅觉减退等［5］。CHH临床表现复杂多样，患者父母均正常。FGFR1基因突变是CHH的常见病因，占CHH患者的6%。其突变类型包括点突变、剪接突变、碱基缺失等［6］。本例患者FGFR1基因突变为c.359-1G>A，来自父亲。多种预测软件都显示，突变导致剪切异常而致病。FGFR1基因发生剪切位点突变并不少见，多数发生在内含子区域［7-11］，G>A改变最多见，这与本患者突变类似。也有部分发生在外显子区域［12］。
通过留取患者外周血，提取mRNA逆转录为cDNA，我们发现患者缺失第4外显子。第4外显子编码的120~150位氨基酸位于FGFR1蛋白胞外区D1与D2之间的酸盒（acid box，AB）。AB可与肝素竞争性结合D2上的肝素受体，从而抑制肝素诱导的FGFR1蛋白激活。同时在结合后，D1可折叠到D2和D3上，成纤维生长因子（FGF）与FGFR1蛋白的结合受阻，影响FGF作用。文献也有2例第4外显子异常致KS的报道，突变分别为c.385A>C（D129A）和c.374_388del［13］。本例患者缺失的一段氨基酸和上述2例患者的异常发生在同一功能域（AB）。因此可以认为，本患者FGFR1蛋白缺失AB会影响蛋白功能，导致GnRH神经元、嗅神经元迁移异常。
CHH的发病机制复杂多变。虽然FGFR1基因突变导致CHH表现为常染色体显性遗传，但一些家系研究表明携带突变者不一定发病。Fadiga等［14］报道1例FGFR1基因点突变c.242T>C（Ile81Thr）女性卡尔曼患者，突变来自表型正常的父亲。Quaynor等报道1例FGFR1基因剪接突变c.2180+3insT导致nCHH，突变来源表型正常的父亲。本患者的突变基因来自表型正常的父亲。通过对父亲的mRNA逆转录产物cDNA的测序以及与正常FGFR1基因转录本的比较，我们发现患者父亲虽然携带剪接突变，但突变并未影响到基因转录。这提示，父亲FGFR1基因转录过程可能被其他因素所代偿。
本研究存在一定局限性。虽然我们利用患者外周血mRNA验证了剪接位点突变导致第4外显子丢失，但未进行细胞功能学和形态学实验以及更深机制的研究。FGFR1剪接位点突变导致FGFR1蛋白功能障碍而致病。虽然父亲携带相同突变，但其FGFR1基因转录本正常，故表型正常。本研究增加了对FGFR1基因突变导致KS的发病机制的认识。
利益冲突
所有作者均声明不存在利益冲突
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