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中山大学戴宗教授、中山大学附属第三医院杨扬教授 Angew:利用卡尺策略分离结构异质的TCR-CD3细胞外囊泡亚群

日期: 来源:化学与材料科学收集编辑:化学与材料科学

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急性细胞排斥反应(ACR)是实体器官移植后最常见的早期免疫排斥反应之一,是移植物衰竭和移植受者死亡的重要危险因素。当前,临床上仍缺乏可靠的无创检测指标用于ACR的诊断。细胞外囊泡(EVs)广泛参与细胞间通讯,在生理过程和疾病进展中发挥着不可替代的作用,可作为疾病诊断的标志物。此外,来自同一亲本细胞的EV亚群,其物理特性和内容物可能存在差异。目前,EV亚群的分离方法通常基于尺寸、密度和蛋白表达量,掩盖了EV表面蛋白的结构和寡聚状态等信息。当ACR发生时,T细胞膜上的TCR-CD3复合体聚集是CD3构象变化和T细胞激活的必要条件。因此,为了更准确地描述T细胞来源的EV亚群在排斥反应中发挥的作用,并寻找新的ACR生物标志物,迫切需要更精确的方法来分离T细胞在不同状态下分泌的EVs。

近日,中山大学生物医学工程学院的戴宗教授团队中山大学附属第三医院肝脏外科暨肝移植中心的杨扬教授团队合作,在国际顶级期刊《Angewandte Chemie International Edition》上发表了题为“Isolation of Structurally Heterogeneous TCR-CD3 Extracellular Vesicle Subpopulations Using Caliper Strategy”的文章(DOI:10.1002/anie.202300954)。文中,作者首次提出了一种基于核酸适配体修饰纳米金的卡尺策略,将两个CD3适配体设计成卡尺形状,优化探针的间距,并将其组装在纳米金上形成Au-Caliper纳米平台。通过构建小鼠ACR模型,从小鼠血浆中分离得到两个T细胞来源的EV亚群,并对其进行表型鉴定和测序分析,结果表明:TCR-CD3二聚体EVs的CD3表达量更多,颗粒尺寸更大。在TCR-CD3单体EVs表达上调的11个microRNAs中,有7个被报道在发生ACR的患者中与免疫激活和促进炎症反应相关,其靶基因在T细胞激活和免疫系统的细胞因子信号中显著富集。该结果提示TCR-CD3单体EVs是ACR潜在的无创检测标志物,并为基于蛋白寡聚状态区分EV亚群提供了参考。该卡尺策略为解构EV亚群的异质性开辟了新方向,有望通过改变卡尺探针的序列和间距应用于更广泛的蛋白质异构EV亚群研究。
本文要点:
1、首次提出了在不同的TCR-CD3寡聚状态下存在异质的EV亚群
基于T细胞膜上的TCR-CD3在移植后急性细胞排斥反应过程中聚集状态改变的事实,作者提出了结构异质性TCR-CD3 EV亚群的存在,有望作为ACR的潜在生物标志物。
原理图1. (a) Au-Caliper的结构示意图,以及卡尺探针与TCR-CD3单体和二聚体的结合偏好性;(b) 结构异质性TCR-CD3 EV亚群的分离机制。
2、提出一种成功鉴定和分离TCR-CD3单体EVs和二聚体EVs的卡尺策略
作者利用两个CD3适配体合理构建卡尺探针,优化探针间距为16 nm。成功将TCR-CD3单体EVs和二聚体EVs从小鼠急性排斥反应模型的血浆中分离出来,捕获得到的EVs结构完整,蛋白质保留良好,进一步释放可获得70%的EVs用于后续的异质性分析。
图1. Au-Caliper的组装验证和Jurkat EVs的表征。(a) 流式细胞术验证适配体ZUCH-1、A1和A2与CD3结合的特异性;(b) 凝胶电泳分析优化探针杂交域长度;(c) DLS检测AuNPs和Au-Caliper的直径;(d) 不同组合比例下的卡尺探针与AuNPs结合前后上清中的核酸浓度;(e) NTA检测Jurkat EVs的尺寸分布;(f) TEM和(g) SEM表征Jurkat EVs的形貌;(h) Western blot检测Jurkat EVs和细胞裂解液的CD3、CD63和GAPDH表达情况。
图2. 验证EVs的捕获和释放。(a) AuNPs, (b) Au-Caliper和(c) Au-Caliper@EVs的SEM、TEM和AFM图像和截面剖面;(d) 采用BCA法检测总EVs和捕获EVs的蛋白质含量;(e) Western blot分析EVs和Jurkat细胞裂解液的CD63、CD3和GAPDH表达情况;(f) 纳米流式细胞术检测EVs在Au-Caliper上与C1和C2孵育前后的荧光分布;NTA检测(g) C1和(h) C2释放EVs的粒径分布。
3、揭示了TCR-CD3单体EVs作为ACR生物标志物的潜力
作者对TCR-CD3单体EVs和二聚体EVs进行了表型和测序分析:TCR-CD3二聚体EVs的CD3表达量更多,颗粒尺寸更大。在TCR-CD3单体EVs表达上调的11个microRNAs中,有7个被报道在发生ACR的患者中与免疫激活和促进炎症反应相关,其靶基因在T细胞激活和免疫系统的细胞因子信号中显著富集。该结果提示TCR-CD3单体EVs是ACR潜在的无创检测标志物,并为基于蛋白寡聚状态区分EV亚群提供了有效参考。
图3. ACR小鼠血浆中EV亚群的表型差异分析。(a) NC组和ACR组移植皮肤的形态变化;(b) NC组和ACR组移植皮切片的H&E染色和CD3抗体免疫组化;(c) 用FITC标记的CD3抗体和纳米流式细胞仪检测EVs的CD3阳性率;(d) 探针间距分别为10、16和20 nm的Au-Caliper分离得到的TCR-CD3单体EVs和二聚体EVs的CD3荧光分布;(e) NTA检测NC和ACR样品中TCR-CD3单体EVs和二聚体EVs的平均粒径。
图4. TCR-CD3单体EVs和二聚体EVs的microRNAs表达谱差异分析。(a) 不同类型非编码RNA的占比;(b) 总microRNAs的主成分分析;(c) 维恩图显示TCR-CD3单体EVs和二聚体EVs富集的microRNA重叠情况;(d) 火山图显示TCR-CD3单体EVs和二聚体EVs中差异表达的microRNAs;(e) TCR-CD3单体EVs和二聚体EVs中差异表达microRNAs的聚类分析;(f) TCR-CD3二聚体EVs和(g) 单体EVs中表达上调的microRNAs的靶基因功能富集分析。
文章的第一作者为中山大学的殷文博士和中山大学附属第三医院的陈海填博士后(共同一作),通讯作者为中山大学的戴宗教授、柳思扬副研究员和中山大学附属第三医院的郑俊博士。上述工作得到了国家自然科学基金、广东省自然科学基金、广州市科技计划项目、广东省科技计划项目和深圳市科技计划项目等基金的支持。

作者简介

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戴宗,博士,中山大学生物医学工程学院教授,博士生导师,中山大学生物医学工程学院副院长。主要研究方向为生物医学传感,包括生化分析与生物传感及电分析化学。任广东省生物医学工程学会传感技术分会副主任委员、广东省化学学会分析化学专业委员会委员等,《中国化学快报》青年编委、《高等学校化学学报》青年执行编委以及《Targets》期刊编委。已在包括J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Adv. Mater.、Nano Lett.、Nucleic Acids Res.、Anal. Chem.、Biosens. & Bioelectron.等国际国内重要刊物上发表SCI论文60余篇,申请专利10余项,参与撰写中英文专著3章。主持国家基金、广东省科技发展专项资金(前沿与关键技术创新方向)项目、深圳市科技计划项目基础研究重点项目、广州市重点研发计划项目等10余项。

杨扬,男,教授、主任医师,博士生导师。中山大学附属第三医院副院长、肝脏外科主任学科带头人。任中华医学会外科学分会委员、移植学组副组长;中华医学会器官移植学分会委员;中国医师协会器官移植医师分会副会长;中国医师协会器官移植医师分会肝移植专业委员会副主任委员;广东省医学会外科学分会主任委员;广东省医师协会器官移植医师分会主任委员;广东省医学会器官移植学分会候任主任委员。《中华肝脏外科手术学杂志》副总编辑、编辑部主任;《器官移植》杂志副主编;《中华医学杂志》、《中华肝胆外科杂志》等杂志编委。擅长肝脏、胆道、门脉高压与胰腺外科疾病的诊断与处理,主持或参与3000余例临床肝脏移植和肝脏肿瘤切除术。以通迅/共同通讯作者在British Medical Journal、Journal of Hepatology、Advanced Science、Hepatology、J Immunother Cancer、Clinical Cancer Research等期刊发表SCI论文60余篇,主持国家自然基金7项、国家科技部重大研发专项等课题20余项,科研经费超过4000万元。作为主要完成人获得国家科技进步二等奖1项、省部级一等奖7项,“肝脏移植关键技术的建立和推广”获得申报单位团队建设“芙兰奖”。 2020年获全国卫生系统新冠肺炎疫情防控工作先进个人荣誉称号,2020年获第二届广东省医师奖。


原文链接

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202300954


相关进展

中山大学潘逸航/何裕隆/曾乐立、戴宗《Adv. Mater.》:新型铜基配位聚合物材料诱导癌细胞铜死亡


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