标题
利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株
作者
陈汉宗，梁颂，黎新月，方宇婷，彭悦景，张宝，赵卫，华颖，万成松
摘要
【目的】利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株，为研究大肠杆菌O157:H7效应蛋白EspF与宿主膜联蛋白A6 (ANXA6)相互作用及其致病机制奠定基础。【方法】根据CRISPR/Cas9靶向原理设计并合成3个特异性识别anxa6基因的向导RNA (single guide RNA, sgRNA)，基于LentiCRISPRv2载体构建LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒，转入293T细胞中，制备sgRNA-Cas9慢病毒，将慢病毒感染Caco-2细胞，经嘌呤霉素筛选阳性细胞，有限稀释法分离培养单克隆细胞，提取单克隆细胞基因组DNA，并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增，测序并进行脱靶效应评估；免疫印记法检测ANXA6蛋白表达情况，细胞计数试剂盒8 (cell counting kit 8, CCK8)试剂盒检测细胞增殖能力，免疫荧光法检测细胞紧密连接分布情况。【结果】Western blotting及序列测序表明anxa6基因敲除单克隆细胞构建成功；脱靶效应评估结果显示预测的10个脱靶位点均无脱靶现象；基因敲除对细胞增殖能力无明显影响；免疫荧光结果显示，Caco-2及Caco-2anxa6‒/‒细胞紧密连接蛋白ZO-1均沿细胞膜连续分布，结构完整，转染EspF质粒后出现分布不完整、缺口等现象。【结论】成功构建anxa6基因稳定敲除的Caco-2细胞株，初步探索ANXA6蛋白在紧密连接分布中的作用，为进一步研究大肠杆菌O157:H7通过EspF-ANXA6互作介导宿主肠屏障损伤分子机制提供技术支撑。
图片摘要
图1 靶向anxa6基因的sgRNA的设计
A：LentiCRISPRv2质粒的结构. B：设计3条sgRNA分别靶向外显子4、5、6，识别相应的序列(PAM：前间隔序列邻近基序；Target：目标序列)
图2 LentiCRISPRv2-sgRNA载体验证结果
A：含重组质粒的Stbl3菌液PCR琼脂糖凝胶验证. Marker：DL2000 DNA分子量标准；R1-1‒R3-2分别表示转化进了3种重组LentiCRISPRv2-sgRNA质粒对应挑取的不同菌落克隆. B：Homo-ANXA6-sg1测序鉴定结果.C：Homo-ANXA6-sg2测序鉴定结果. D：Homo-ANXA6-sg3测序鉴定结果
图3免疫印迹验证ANXA6蛋白表达情况
1‒4：sgRNA1-Cas9慢病毒侵染的Caco-2单克隆细胞；WT：正常Caco-2细胞
图4 DNA测序结果
A：正常Caco-2细胞的测序结果. B：ANXA6-sgRNA1-1的测序结果. C：单克隆细胞anxa6基因在Caco-2细胞中的缺失突变.红色标记为初始设计的sgRNA序列，“–”为突变后缺失的碱基
图5 anxa6基因敲除对Caco-2细胞增殖的影响
图6 EspF蛋白破坏紧密连接蛋白ZO-1分布图(60×油镜)
绿色为质粒所表达的荧光；红色为ZO-1蛋白；蓝色为DAPI染核.A：用pEGFP (E)、pEGFP-EspF (EE)质粒转染Caco-2细胞后ZO-1分布图. B：用pEGFP (E)、pEGFP-EspF (EE)质粒转染稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞后ZO-1分布图. C：Caco-2细胞ZO-1的荧光强度分析图. D：稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞ZO-1的荧光强度分析图
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