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做了 30 多年免疫沉淀,我总结了这些经验

日期: 来源:丁香学术收集编辑:

说起蛋白互作实验,多少占点「玄学」,不是 co-IP 拉不下来蛋白,就是拉下来的蛋白被抗体条带覆盖住了。


点此抢先看「co-IP 拉不下来蛋白、蛋白被抗体条带覆盖」原因分析


co-IP 拉不下来蛋白可能是因为抗体与 beads 结合效率低、抗体与目的蛋白结合效率低或者蛋白洗脱效率低。建议选择亲和力更高的抗体,使用与抗体匹配的介质,推荐进行温和非变性洗脱。


而蛋白被抗体条带覆盖这种现象,又称为抗体条带干扰或抗体轻重链污染。其主要原因就是二抗识别了 co-IP 产物中的一抗抗体。此时建议采用交联剂或用活化固定介质将抗体固定到支持物或磁珠上,使用只识别天然构象抗体的二抗。


实验过程中,除了上述这种没条带,条带污染现象,(过来人表示)其他问题也层出不穷,如背景很深的或者条带杂乱,目的条带位置不对的……..说多了都是泪!那要怎么快速掌握这项实验,轻松搞定各种疑难杂症呢?不要担心,打败 IP/co-IP,无需魔法,我们帮你搞定!


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● 如何区分 IP、co-IP、pull-down。

● 如何正确设立实验阴性对照,排除假阳性?

● 靶蛋白正好和抗体重链分子量接近,应该如何减少抗体干扰?

● 靶蛋白没有条带怎么办?实验用基质选择琼脂糖还是磁珠?

......


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课程简介



内容策划:邹礼平
内容审核:吴军

题图来源:图虫创意


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