液相色谱缓冲液如何选择？

2023-03-01

在液相色谱中，给你一个样品，怎么来选择流动相将样品分开呢？在什么情况下使用缓冲溶液呢？？缓冲溶液的选择有什么技术要求？

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一、缓冲液的选择

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当分离酸性或碱性样品时，通常需加入一定量的缓冲盐，缓冲盐的浓度及类型如何确定？

1、缓冲盐的浓度

缓冲盐的浓度对离子样品保留值的影响通常较小，浓度一般为10-50mmol/l。

2、缓冲盐的类型

缓冲盐类型的选择，主要取决于所需要的缓冲能力，在反向色谱中，流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。对于离子型化合物，典型的样品的保留随pH改变而明显变化。

通常在pH2到4条件下，保留时间对pH的微小改变稳定性最高。因此建议将这一pH范围作为大多数样品方法开发的起始pH，包括碱性化合物和一般的弱酸。缓冲盐溶液的pH值越接近其pka，缓冲能力越强。一般缓冲盐溶液的pH值应在其pka±1的范围内.

3、缓冲盐的离子缔合

如酸性条件下分离碱性化合物，加入NH4CL，碱性物质离子与反离子相互作用的平衡导致它们相互的溶剂化并形成相关复合物离子：[碱]+[Cl]?=[碱+--Cl?]，在低pH时，碱性化合物被完成质子化，溶液阴离子（如CL-）在流动相中破坏了碱性物周围的水分子并增加其疏水性，导致样品保留时间增加，当盐浓度大于50mM时，保留时间略有下降[4]，这可能是饱和反离子CI-引起的离子相互作用的屏蔽作用。此外还可以添加硫酸钠或者高氯酸钠等改变碱性化合物的保留。

4、缓冲盐的其它性质

缓冲盐的溶解性、挥发性和稳定性（可能与设备、样品和或色谱柱发生作用）对某些分离也很重要。如磷酸盐，在含有高浓度有机相（70%以上），可能会析出；一些缓冲剂放置即降解，贮存或长期使用后其紫外吸收会增加（如：TFA、三乙胺）；一些缓冲盐能通过形成离子对，对样品发生作用（如三氟醋酸缓冲剂与阳离子样品，三乙胺与阴离子样品等）；挥发性的缓冲盐如碳酸胺、甲酸铵、醋酸铵等可应用于蒸发光散射、质谱的检测。

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二、峰拖尾常见原因及应对方法

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1、HPLC体系中存在过大的死体积，导致一部分的分析物在这些空间里滞留过长的时间而表现为拖尾。

这种拖尾是对于每一个色谱峰都存在的，因此当出现每个色谱峰都拖尾时，有可能就是这个原因。以前就遇到过这个问题，仪器增加了一个模块，死体积增加，峰又胖又拖尾。

应对方法：更换更短、内径更小的管路；检查部件的连接是否紧密；检查保护柱或者在线过滤器的安装是否合适（这个尤为常见）；换到表现正常的仪器排查下是否是色谱柱的原因等。

2、在HPLC柱中存在两种或以上的吸附位点，这两个位点与分析物作用的非均一性。

有的固定相表面存在大量低能量吸附位点，这种吸附位点与分析物的作用是非选择性的，包括色散或者简单的极性作用。有的固定相表面同时存在少量的高能吸附位点，这种吸附位点与分析物的作用是有选择性或者特异性的，包括氢键作用、离子交换作用和螯合作用等，不同吸附位点作用力不同导致峰拖尾。

应对方法：通过改变流动相条件（如添加剂，pH值等）或者针对性地更换色谱柱来减少拖尾。

3、色谱柱过载。

当样品进样量过大，使色谱柱出现过载时，色谱峰也会表现出拖尾。特别是带电荷的化合物时，当保留在固定相上时会因为静电排斥而大大降低其载样量。

应对方法：可以通过降低进样量观察峰形是否改善来确定是否是过载导致的峰拖尾。对于由于带电荷的化合物，可以通过调节pH值（比如把化合物调至中性状态）或者加入离子对试剂来改善峰形。

4、色谱柱柱头污染或筛板部分堵塞。

这样导致分析物分子中的一部分滞留时间增加从而导致拖尾。

应对方法：这种情况一般表现为色谱图的所有色谱峰都出现拖尾，可以通过更换同款色谱柱来排查或者反接色谱柱（如果确定色谱柱可以反接）观察峰形是否改善来判断。

文章来源：质谱学堂

转载平台：质谱学堂

责任编辑：胡静

审核人：何发

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