Mo固氮酶催化辅因子（FeMo-co）的化学键是构建生物固氮机制的基础。实现这一目标的持久障碍之一是，基于⁵⁷Fe的光谱数据结合了所有7个Fe位点的响应，因此不可能将单个光谱响应映射到三维结构中的特定位点。

鉴于此，近日，美国麻省理工学院Edward D. Badding，Daniel L. M. Suess等在《Nature Chemistry》上发表题为“Connecting the geometric and electronic structures of the nitrogenase iron–molybdenum cofactor through site-selective ⁵⁷Fe  labelling”的研究成果。

固氮酶催化将N₂还原为NH₃(图1a)，并与Haber-Bosch过程一起负责生产维持地球上生命的绝大多数固定氮，然而，铁钼辅基中开放壳层金属离子的数量极大地限制了计算分析的范围，并且在实验表征方面也存在一些挑战。尽管可以使用Mo特异性光谱技术选择性地探测FeMo-co中的Mo中心，但对单个Fe中心的研究更加困难。特别是，⁵⁷Fe穆斯堡尔谱和电子-核双共振(ENDOR)光谱中包含的丰富信息，包括Fe氧化态、Fe - s /C和Fe - Fe/Mo相互作用的共价、局部自旋态和局部自旋相对于总自旋的方向，一直是难以提取的，因为⁵⁷Fe光谱数据无法映射到几何结构上(图1b)。研究团队克服这些挑战的策略是选择性地富集FeMo-co中的个别Fe位点(图1c)。对这些样品的分析将同时克服光谱分辨率差的问题，并提供关于个别铁中心化学键合的特定地点信息。

图1：利用位点选择性同位素标记，了解生物固氮机制

研究将⁵⁷Fe结合到FeMo-co的Fe1位点的方法包括：(1)使用报道的方法从Mo固氮酶(NifDK)的MoFe蛋白中提取FeMo-co到n -甲基甲酰胺(NMF)中，(2)使用螯合剂去除Fe1位点，(3)用⁵⁷Fe重组Fe1位点，(4)将标记的辅因子重新插入到apo-NifDK中，该apo-NifDK包含p簇，其中包含P-簇而不是铁钼辅基。研究组首先通过电子顺磁能谱(EPR)能谱研究了步骤(2)和(3)(图2)。当处于MN状态时(通过与二亚硫酸钠(DTH)孵卵获得)，分离的FeMo-co表现出扩宽的S = 3/2信号，在噻吩存在时变得更锐(图2b上)。

图2：生物合成后⁵⁷Fe掺入铁钼辅基

研究组随后先用EDTA处理M (⁵⁷Fe7)，然后用自然丰度Fe²⁺，生成了位点选择性标记的样品Nif DK-M(⁵⁷Fe6)；用EDTA处理自然丰度的铁钼辅基后再用⁵⁷Fe²⁺生成了Nif DK-M(⁵⁷Fe1) (图3a)。这些样品以及NifDK-M(⁵⁷Fe7)显示出充分的C₂H₂还原活性，并清晰地显示出原生Mo固氮酶静息态的S = 3/2 EPR信号(图3b)，表明该研究用EDTA和Fe²⁺生物合成后处理不影响FeMo-co的结构、组成或重新插入apo-NifDK生成活性holo-NifDK的能力。电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对NifDK-M (⁵⁷Fe1)样品56/57Fe含量的分析表明，接近定量标记效率(~90%，假设Fe1位点完全选择性;详见补充图2和补充资料)。正如接下来讨论的，当这些样品处于MN状态时，在Mössbauer和ENDOR光谱中，⁵⁷Fe标记的本质定量位点选择性是明显的(图3c,d)。

图3：位点选择性标记的全holo-NifDK样品的制备和表征

目前的工作证实了A₂和a₂信号之间的这种对应关系，以及从分析x波段ENDOR信号的场依赖性中导出的超精细张量。在g₃=2.01和g₁=4.30记录的选择性标记NifDK-M(⁵⁷Fe1)样品的q波段ENDOR光谱显示的特征分别集中在~10和~16 MHz(图4a)，这些特征是使用先前ENDOR模拟得到的单个⁵⁷Fe位点的超精细张量和相关欧拉角再现的。值得注意的是，观察到的⁵⁷Fe1双态在g₁处的Larmor分裂是“零”的，因此观察到的是单峰，而不是g₃处的良好分辨的双态(图4a)，这直接揭示了Fe1超精细耦合符号为负。

图4：NifDK–M(⁵⁷Fe1) 样品的表征

本文报道了一种将⁵⁷Fe位点选择性掺入FeMo-co的化学方法，并展示了位点选择性标记样品的分析如何影响FeMo-co中价电子的分布和耦合。该研究进一步证明:(1)Fe1位点是Fe2.5+离子混价对的一部分，(2)这对混价对是静息态中被还原最多的部分，(3)在N2还原的第一中间体E1中，Fe1位点的价位和主配位球得以维持。总的来说，这些发现限制了FeMo-co在多种状态下的电子结构，而观察到Fe1位点上的⁵⁷Fe标签在翻转过程中不会发生混乱，这表明位点选择性同位素编辑有望为生物固氮机制提供见解。

回复“Mo”查看原文内容

参考文献

Edward D.Badding, Suppachai Srisantitham, Dmitiy A. Lukoyanow, Brian M Hoffman & Daniel L M. Suess

https://doi.org/10.1038/s41557-023-01154-9