小分子药物发现工作的成败，在很大程度上取决于开始时所选用的“苗头化合物（hit）”发现方法。传统的高通量筛选方法，是将靶点蛋白暴露于小分子库，通过单个化合物逐一筛选找到可以与靶点蛋白结合的小分子hit。这一方法无疑费时费力，成本高昂。为了解决这个问题，科学家们想到用小片段DNA标记分子，合成DNA编码化合物库（DNA-encoded libraries，DELs）。如此一来，每个小分子都有独特的DNA片段标记，像是打上了“条形码”，可以将靶点蛋白同时和整个库中的所有化合物进行孵育和筛选，只需通过已商业化的扩增和测序技术读取与靶点蛋白结合小分子的DNA“条形码”中存储的信息，就可以确定小分子hit的“身份”。相比传统方法，DELs具有显著的速度和成本优势，而且还支持非常巨大的库容量（可达到千亿数量级），涵盖更广阔的化学空间。目前，DELs已广泛应用于生物医学和药物发现研究。但是（又要说“但是”），这项技术也存在一定的局限性。作为“条形码”的DNA片段与多种化学反应条件不相容，限制了可用的反应类型，能够合成的化合物骨架类型有限，此外也可能因为意外的断裂或脱嘌呤反应导致存储信息的丢失；如果靶点蛋白能够结合DNA，则DELs可能导致假阳性。除了DNA之外，肽作为氨基酸聚合物，在信息存储方面也具有巨大的潜力（图1A）。通常情况下，纳米级液相色谱-串联质谱分析法（nLC-MS/MS）可用于解码存储在肽中的信息，而肽中的信息编码则可以通过固相肽合成（SPPS）来完成。那么，肽能不能代替DNA，在编码化合物库方向上贡献力量呢？ 近日，美国麻省理工学院（MIT）的Stephen L. Buchwald和Bradley L. Pentelute等研究者在Science 上发表论文，设计非生物肽作为信息载体编码小分子合成，构建了肽编码化合物库（peptide-encoded libraries, PELs）（图1B）。经过精心设计，编码肽具有较高的信息密度和化学稳定性。其序列经过优化以微调极性并使其易于测序，可通过串联质谱实现高保真解码。这种肽“条形码”标签的化学稳定性良好，耐受多种反应条件，给小分子的转化带了合成多样性，包括目前DELs不兼容的酸性条件或过渡金属催化。作为验证，他们构建了包含数万类药小分子的PELs，并筛选出对碳酸酐酶IX、BRD4和MDM2具有高亲和力的小分子。图1. 肽存储信息的潜力，PELs构建与小分子hit筛选。图片来源：Science 作者确定了一组包含16个氨基酸单体的信息单元（图2A），在适当保护其侧链的情况下，天然和非天然氨基酸很容易通过化学合成引入。如图2A中由11个氨基酸单体组成的肽标签，其中有4个间隔单体（绿色三角和蓝色菱形），这些单体出现在固定位置，从而通过在数据筛选期间充当结构限制来增加测序保真度；而灰框所示为编码位，8个编码位（其中1个是间隔体）中每一个都可被16个氨基酸单体之一占据（16进制），从而提供理论上43亿种不同编码，远远高于2进制和4进制（DEL的四种DNA碱基）的编码容量（图2C）。此外，碱性残基增强了所得肽标签的溶解度并提高了测序准确性，而质子性侧链可微调极性。筛选不同固定位置的碱性和质子性残基得到了最佳标签结构，其特点是C-末端和N-末端附近有一个赖氨酸，标签的核心有一个丝氨酸，N-末端有一个脂肪族残基。而肽标签所编码信息，很容易可以通过nLC-MS/MS进行解码（图2B）。事实上，经过优化后可使用nLC-MS/MS成功测序低至10 fmol的肽标签。图2. 肽标签可实现高稳定性、高容量的信息存储。图片来源：Science 如图3所示，PEL技术相对于DEL的优势是多方面的。最值得注意的是，PEL技术更稳定，可支持更苛刻和更多样化的化学反应，包括金属催化反应和需要强酸或强碱条件的反应，这意味着PEL技术能够合成更广泛的类药物分子。另一个优势是肽和小分子固相合成的应用可使用过量的反应物，这反过来又会获得更高产率和纯度的最终小分子，从而有望显著提高化合物库的质量。图3. 模型肽和DNA标签在相关条件下的稳定性。图片来源：Science 接下来，作者设计了一个具有两个用于正交合成位点的分子骨架（图4A），可通过完全正交保护基策略实现连续的小分子和肽合成来合成PEL。该分子骨架通过Rink酰胺linker与固相载体聚苯乙烯珠结合，这种linker可在强酸性条件下裂解（同时导致全局去保护）；赖氨酸残基作为分支点，共价连接肽和小分子；肽通过Seramox linker（Smx）连接到分子骨架上，在优化的氧化条件下可进行正交切割，释放肽进行测序。肽和小分子依次使用正交保护基团（Fmoc、Trt、Alloc）进行官能团化，从而在相应的小分子官能团化之前或之后通过特定氨基酸与肽的偶联进行编码。如图4B所示，基于受保护肽的化学稳定性和固相合成法的优势，作者可进行钯介导的交叉偶联反应。对于钯介导的C-C键形成反应，作者发现具有联芳基膦配体XPhos的第四代钯预催化剂（XPhos Pd G4）能够有效地实现36种芳基硼酸与14种树脂结合的芳基溴化物-肽缀合物的交叉偶联反应，并且其纯度足够用于库合成（>70%纯度）。类似地，AlPhos连接的钯二聚体能够有效地实现41种苯胺衍生物与11种树脂结合的溴化物-肽缀合物的交叉偶联反应，其纯度同样能用于库合成（>70%纯度）。需要指出的是，这些反应的底物范围和纯度明显优于DNA存在下钯介导的交叉偶联反应，从而可实现药物中普遍存在的各种杂环的交叉偶联（图4C）。通过酸介导的Pictet-Spengler反应，进一步确定了肽标签与不同合成条件的兼容性，而先前的报道即使在稳定的DEL体系中，该反应也会导致编码信息丢失。作者使用组合化学制备了两个PELs，该化合物库的特征是中心构建砌块（BB1）含有偶联羧酸构建砌块（BB2）的受保护胺以及用于钯介导胺或硼酸（BB3）交叉偶联反应的芳基溴，从而分别得到了41000分子的C-N基化合物库或39000分子的C-C基化合物库。值得注意的是，固相合成的高效率使得这种多步骤化合物库合成能够在不到一周的时间内进行。另外，对单个化合物库成员的类药性进行的定量评估表明，大多数化合物令人满意的性质（图4E）。图4. 由3个砌块和11个编码氨基酸形成的小分子-肽缀合物。图片来源：Science 作者将这两个PELs用于亲和力筛选，以发现对碳酸酐酶IX（CA IX）具有纳摩尔亲和力的小分子（图5A）。在自动化程序中，生物素化的CA IX被固定在具有链霉亲和素的磁珠上并与PEL一起孵育。随后，通过重复的洗涤步骤去除非结合分子。保留的缀合物中，编码肽在氧化条件下释放，并通过nLC-MS/MS进行分析。他们从PELs中获得了11个hit分子，并在2天的时间内在固相载体上方便合成，仅需要一次纯化。验证结果显示，所有hit分子表现出数纳摩尔至数十纳摩尔范围内的CA IX亲和力（图5B）。此外，基于PEL，作者也发现了对BRD4和MDM2具有高亲和力的hit分子（图6）。图5. 基于PEL发现对CA IX具有高亲和力的小分子。图片来源：Science 图6. 基于PEL发现对BRD4和MDM2具有高亲和力的小分子。图片来源：Science 总结 本文作者证明了非生物肽作为信息存储介质可用于编码小分子合成，并构建了新的药物发现平台——肽编码化合物库PELs。源自PEL的hit再合成，仍然可以使用与构建库相同的条件通过固相合成进行，这使得合成过程更快速并使潜在副产物的识别更容易。PELs可以被看作下一代编码库技术的起点之一，对药物发现和生物化学研究将产生广泛的影响。 原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：Abiotic peptides as carriers of information for the encoding of small-molecule library synthesisSimon L. Rössler, Nathalie M. Grob, Stephen L. Buchwald, Bradley L. PenteluteScience, 2023, 379, 939-945, DOI: 10.1126/science.adf1354 点击“阅读原文”，查看 化学 • 材料 领域所有收录期刊