日期：
来源：研之成理收集编辑：LHSRYY
https://doi.org/10.1038/s41557-022-01127-4
生物体中超过一半的天然纳米机器是多聚体的，并可能利用其组件的自组装来提供功能上的优势。然而，利用多种分子组分构建纳米体系的优势和不足在热力学、动力学和功能水平上仍相对未被探索。1.本工作使用了理论和一个简单的基于DNA的模型，形成了相同的纳米结构和不同数量的成分，以提高本工作在这个领域的知识。尽管其组装率较低，但本工作发现由3个组件构建的系统可能经历了从较少预组织的组件更多的合作组装转变。2.利用其组分的简单变化，本工作还发现三聚体纳米系统显示出比其二聚体纳米系统更高的可编程性，因为它们可以组装具有不同程度的协同性、自抑制和时间特性。3.本工作在这里展示了如何使用两个简单的策略(例如,切割和添加组件)来有效地编程一个更复杂的、人工选择的、切割RNA的催化纳米系统的调节功能。
▲图1. 用一个、两个或三个分子组分构建的纳米体系的热力学和动力学表征
1、为了探索将一个自组装的纳米系统分解成更多的组分是否能够实现新的调控功能的编程，本工作设计了一个包含可编程相互作用表面的简单的DNA三向连接系统(图1a)。由于其相互作用的高度可预测性和可编程性、易于合成、化学修饰以及能够创建特定的、定义良好的和高度可溶性的结构，本工作使用DNA来重新创建多组分生物组装体而不是蛋白质。2、本工作首先利用化学和热变性程序，通过测定组装和解组装构象之间的能量差ΔGAss，表征了由一个、两个或三个组分构建的三向结的组装热力学。尿素变性曲线通常提供两个重要参数：(1)无尿素时ΔGAss(ΔG°Ass)的估计；(2) m值，它与解聚时暴露于溶剂中的表面积的数量有关。3、然后本工作测定了这些纳米体系的组装动力学，结果如预期的那样，它们的组装速率随着组分数量的增加而急剧下降。这与单分子反应通常快于多分子反应的事实相一致，并且在观察到的组装转变发生之前，在1C和2C纳米体系(即预组织的发夹结构)中已经形成了许多相互作用。从组装和拆卸动力学估算的ΔG°Ass和m值进一步支持了预组织结构的存在，因为它们在平衡实验确定的值的实验误差之内。4、本工作发现，由于锁定在预组织发夹结构中的核苷酸的可及性较低，1C系统不能被这种经典的互补DNA抑制剂所抑制。相比之下，2C和3C体系对抑制剂越来越敏感，因为它们在其解聚态(m值较高)中具有更多的暴露表面，从而表现出更好的发展更多调节机制的能力。▲图2. 随着组件数量的增加，纳米系统的组装变得更加可编程(可调控)
1、然后，本工作确定了改变纳米体系组分数量对其组装机制的影响。单分子纳米系统的组装机制，如DNA或蛋白质结构的折叠，可以在毫秒到小时内发生，通常很难编程，因为它主要取决于它们的结构的复杂性。2、调控这些系统的典型策略一般需要借助外部分子，如变构效应子，它们会降低(抑制剂)或增强(激活剂)它们的活性。相比之下，二聚体2C系统的组装可以通过调节其中一个组分(本文称A)的浓度来调节，从而产生经典的剂量-反应行为(图2a)，并具有两个可编程参数：(1)中点或[ A]50%，即组装50%系统的浓度；(2)响应或动态范围(DR)的协同性，即转变的宽泛性，定义为响应从10%到90%变化所需的[A]的变化。3、本工作还使用了本工作的数值模拟来深入了解一个可以潜在分为三个以上分子组分的系统。总的来说，这些结果表明，组装由两个以上组分组成的纳米结构的过程可以编程，比结构相似的1C或2C系统具有更多样的调控模式。▲图3. 三聚体组装体上的特定突变比其二聚体组装体上的突变更有影响，并能导致新的调控机制
1、特定的突变可以对3C系统的组装轮廓产生更剧烈的影响。而2C体系的组装是由两个单体的简单二聚构成，3C体系的组装则是在三聚体结构(图3a,顶部)形成之前，由多个二聚中间体的组装构成。2、因此，本工作探索了在不影响二聚体中间体(ΔG°Dim)稳定性的情况下，特异性影响三聚体三向连接(ΔG°Tri)稳定性的突变是否可以为功能多样化提供新的途径。通过热变性(图3a)，本工作证实这些突变并不影响二聚体中间体的稳定性，但使三聚体的稳定性降低了3.6±0.6 kcal mol-1(4T)和6.3±1.1 kcal mol-1(0T)。这些突变极大地影响了3C系统的组装轮廓，尽管对结构相似的2C系统的组装没有影响。3、虽然最稳定的2T三聚体系统以高度协同的方式组装(DR=21±5)，但轻度失稳的4T系统表现出更少的协同组装(DR=73±18)，而最不稳定的0T系统则以一种新的自抑制形式组装。在这个自抑制谱中，当[A]从5增加到200 nM时，组装三聚体的百分比从10%增加到70%，然后当[A]进一步增加到10 µM时，组装三聚体的百分比下降到10%。总之，这些结果表明，除了允许新的调节机制，三聚体组装体也比它们的二聚体组装体对小扰动或突变更敏感。▲图4. 通过利用二聚体动力学陷阱来编程三聚体纳米系统随时间的组装
▲图5. 通过片段化在复杂的催化纳米系统中编程新的调控机制
1、虽然上述的调控机制都是在平衡状态下发生的，多组分纳米体系的组装也可以通过动力学来控制。将组件数量增加到两个可以很容易地通过利用质量作用定律来编程组装速率。例如，在低浓度B(10 nM)的情况下，将A的浓度从100 nM增加到600 nM，观察到的组装速率(kobs)增加了6倍。2、然而，对于3C体系，过量的A组分(100~600 nM)与较低浓度的B和C组分(10 nM)混合会将这两种组分捕获在非功能二聚体中间体AB和AC(图4a,右)中。然后，这些二聚体的解离需要通过先前分离的组分B和C的缓慢结合来实现三聚体的形成，从而产生双相动力学。3、本工作证实了最快的阶段kDim代表二聚体AB和AC的形成，因为它们与单体A的浓度呈线性依赖关系。相反，最慢的阶段kTri代表三聚体的形成，并受生成的二聚体BC的形成速率限制，从而解释了其对组分A浓度的不敏感性。4、所有这些结果证明，通过利用质量作用定律和简单的动力学陷阱，构建具有多个分子组分的纳米体系可以产生可编程的时间依赖纳米体系。这种具有时间依赖性的纳米系统存在于各种生化过程中，如信号转导、蛋白质合成和细胞周期，在未来的自调控纳米技术中具有广阔的应用前景。5、在这项研究中，本工作的3C体系作为一个方便的合成工具包来定量评估碎片和组分数量对纳米系统功能的影响，以及这种影响在多大程度上可以被利用来创建新的调节机制。总的来说，这些结果证明了通过增加参与组装的组件数量来编程和优化复杂纳米系统功能的片段化策略的简单性和有效性。https://www.nature.com/articles/s41557-022-01127-4更多科研作图、软件使用、表征分析、SCI 写作、名师介绍等干货知识请进入后台自主查询。