免疫抑制的肿瘤微环境是阻碍胰腺癌和其他实体瘤治疗的主要因素之一。干扰素基因刺激物(STING)蛋白激动剂可以触发炎症性先天免疫反应，会改善肿瘤的免疫抑制性，但是其机制尚不清楚。
在下文中，作者在各种胰腺癌模型中应用STING激动剂。作者发现B细胞中的STING信号的缺失可以更好的控制肿瘤。此外，使用IL-35阻滞剂或基因切除B细胞中的IL-35也可以减少肿瘤的生长。B细胞中的STING-IL-35轴会减少自然杀伤(NK)细胞的增殖，并减弱NK驱动的抗肿瘤反应。
为了研究体内胰腺导管腺癌（PDAC）对注射STING激动剂的应答反应，作者在小鼠体内获得PDAC KPC4662细胞系，并注射到WT小鼠体内建立荷瘤模型，待肿瘤成型后，静脉注射cGAMP，并在种植肿瘤的11，17，21天收集肿瘤进行分析，发现cGAMP并不影响肿瘤生长，也不影响肿瘤和脾脏中CD45+细胞的数量。然而在21天的时候，肿瘤中CD19+B细胞在CD45+细胞中占比上调，且B细胞的绝对数量增加。
为了研究STING在B细胞中的作用，作者比较了两个原位PDAC肿瘤系(KPC2173和KPC4662)在对照组小鼠(Tmem173fl/fl)和B细胞特异性缺失STING 1(也称为Tmem173)基因的小鼠(Cd19cre Tmem173fl/fl)中的生长情况。结果发现，相比于对照组Tmem173fl/fl小鼠，Cd19cre Tmem173fl/fl小鼠肿瘤负荷均降低。同时，利用相同的模型，分别接种三阴乳腺癌细胞系E0771和Lewis肺癌细胞系LLC以及B16-OVA黑色素瘤细胞系，也得到了类似的结果。
为了探讨cGAMP（一种STING激动剂）对B细胞的影响，作者对WT和Tem173缺陷(Tmem173−/−)小鼠的B细胞进行了RNA测序分析。作者发现cGAMP在WT中上调了IL10和Ebi3mRNA，但在Tem173−/−B细胞中没有上调。Ebi3是免疫抑制细胞因子IL-27和IL-35的一个亚单位，同时也是IL-12家族的成员。在B细胞中，IL-12家族成员的其他转录本则不受cGAMP的影响，而IL27、IL23a和IL12b的表达几乎检测不到。RT-PCR分析也证实了这些结果，结果表明，anti-IgM plus cGAMP能增加WT中EBI3、IL10、IFNA和IFNB1的表达，但对Tmem173−/−B细胞中EBI3、IL10、IFNA和IFNB1的表达没有影响，而p35mRNA水平保持不变（图1）。
为了确认cGAMP诱导IL-10和IL-35，作者进一步展开了体外实验，发现cGAMP可以增加WT中IL-35和IL-10的频率，但对Tmem173−/−B细胞没有影响。这些CD19+IL-35+细胞是CD1dhiCD5+CD21hi B细胞，这是小鼠Breg细胞的表型特征。与单独anti-IgM相比，cGAMP加anti-IgM会进一步增加IL-10的产生和CD19+CD1dhiCD5+CD21hi Breg细胞的频率。
作者接下来测试了其他STING激动剂，如DMXAA，diABZI，ADU-S100和MSA-2，结果与cGAMP类似：能提高小鼠脾脏或肿瘤中IL-35+和IL10+Breg的频率。但是对于cGAMP，DMXAA和diABZI并没有减少肿瘤的生长。但增加了肿瘤和脾中CD19+IL-35+细胞的百分比，并增加了脾CD19+B细胞中EBI3和p35的水平。cGAMP还可提高瘤内B细胞中IL-35+CD19+和IL-10+CD19+细胞的比例（图2）。
为了进一步研究 STING介导的Breg信号通路，作者敲除了B细胞的Tmem173或IRF3后，激动剂信号刺激并不影响IL-35+和IL-10+B细胞频率变化；CHIP实验显示，激动剂刺激条件下，IRF3结合EBI3，p35和IL-10的启动子的强度增加，说明CD19+B细胞中IL-35和IL-10表达上调是通过STING- IRF3信号通路。同时体内试验显示，注射cGAMP后，WT小鼠肿瘤和脾脏中IL-35和IL-10的水平显著升高，肿瘤负荷更强，但是Cd19creTmem173fl/fl小鼠中，IL-35和IL-10不受cGAMP调控，注射前后均维持不变。
接下来，作者研究了PDAC中IL-35和IL-10的来源。随着肿瘤的生长，这两种细胞因子在肿瘤中都增加了，cGAMP可以增加这些细胞因子在肿瘤中的表达。在B细胞缺陷的小鼠中，肿瘤内的IL-35和IL-10几乎消失，表明这些细胞因子来自B细胞。在cGAMP治疗的CD19creTem173 fl/fl PDAC荷瘤小鼠中，IL-35和IL-10保持在基线水平，表明B细胞中的STING通路是增加IL-35和IL-10所必需的。为了分析这些免疫抑制细胞因子对肿瘤的影响，作者发现KPC4662肿瘤中IL-35和IL-10的增加与肿瘤重量呈正相关，与肿瘤浸润性CD8+、CD4+和NK1.1+效应细胞呈负相关(图2)。
接下来，作者研究了cGAMP对EBI3、p35或IL10 B细胞特异性缺陷小鼠的治疗效果，分别命名为B(EBI3−/−)(CD19creEbi3fl/fl)、B(p35−/−)和B(IL10−/−)。将这些菌株原位注射KPC细胞，并用PBS或cGAMP处理，作者发现cGAMP能有效抑制B（BEbi3−/−）和B（p35-/-）小鼠肿瘤生长。
相反，cGAMP促进了B（Ebi3+/-），B（WT），B（Il10-/-）小鼠肿瘤中IL-35+B细胞的浸润。同时，敲除B细胞中的Ebi3或p35后，略微增加了肿瘤内NK细胞的水平；cGAMP处理后，NK GzmB+细胞频率显著提高。而其他类型的免疫细胞，如IL-35+或IL-10+ CD4+T细胞，均不受cGAMP 影响，说明Breg特异性来源的IL-35会导致NK细胞频率降低（图3）。
接下来，作者评估了cGAMP联合IL-35或IL-10中和抗体是否可以控制PDAC、LLC或B16-OVA黑色素瘤的生长。小鼠模型验证发现，相比单体治疗，联合治疗能有效提高NK1.1+或NK1.1+GzmB+细胞以及CD8+TNF+T细胞的肿瘤浸润，并有效降低肿瘤负荷，提高生存率。但在消除小鼠的NK1.1+细胞或CD8+T细胞后发现，联合治疗的有效性只在缺失NK1.1+细胞的小鼠中出现，说明联合治疗的抗肿瘤效应是由NK细胞介导的。同时体外实验显示，IL-35通过降低NK细胞的TRAIL的表达继而削弱其细胞杀伤功能。
由于cGAMP和anti-IL-35的结合增加了原位PDAC中NK1.1+和CD8+亚群的数量，作者通过耗尽NK或CD8+T细胞来测试这些细胞类型在肿瘤抑制中的相关性。当NK1.1+细胞耗尽时，cGAMP加anti-IL-35治疗后的肿瘤减少的现象就消失了。这说明双重治疗的抗肿瘤作用是由NK细胞介导的。
为了进一步探讨IL-35和NK细胞之间的这种联系，作者在体外将NK细胞系NK-92MI与IL-35共同孵育，发现IL-35处理降低了NK细胞对K562的杀伤活性(K562是一种典型的NK靶细胞)。为了探索降低NK细胞毒性的可能机制，作者检测了NK杀伤的关键介质TRAIL的表达，结果表明IL-35降低了NK细胞中TRAIL的表达水平。最后，anti-TRAIL中和抗体在双重治疗后削弱了肿瘤减少的现象（图4）。
图4 抗IL-35与STING激动剂协同增强NK细胞效应
进一步解析cGAMP和anti-IL-35联合治疗是如何影响肿瘤内NK细胞功能。作者分离了药物单药/联合治疗的小鼠肿瘤模型中的NK细胞，通过单细胞测序和GSEA分析发现多条通路受到药物治疗的影响而增强，其中包括细胞增殖，细胞发育，细胞杀伤功能。联合治疗提高了NK细胞的增殖，表现为肿瘤内NK1.1+Ki 67+细胞的比例和频率显著提高。为了区分联合治疗和单一治疗的效果，作者注意到联合治疗与对照组相比上调了358和下调了610的DEGs，cGAMP或anti-IL-35组与对照组相比没有变化。单药处理没有明显改变，但联合处理增加的基因包括Tubb1，促进细胞增殖。
作者的研究结果发现联合治疗会导致NK细胞增殖，具体的表现为肿瘤中NK1.1+Ki67+细胞总数和百分比的增加。为了研究人类胰腺肿瘤中STING和免疫抑制细胞因子之间的联系，作者研究了TCGA的胰腺癌数据集。数据显示，人类EBI3，IL12A，IL0的表达和Tmem173的转录是呈正相关。cGAMP处理能上调健康人或胰腺癌患者B细胞中EBI3，IL2A的表达。通过分析B细胞亚型，发现cGAMP处理后，选择性的上调未成熟B细胞以及Br1细胞中EBI3和IL12 A的表达水平。最后，数据调取分析显示，胰腺癌中，Breg细胞表型和NK细胞活化表型呈负相关。
图5 STING激动剂治疗可以通过IL-35抑制NK细胞介导的抗肿瘤反应
综上，整篇研究揭示了肿瘤抵抗STING激动剂单药治疗的可能机制。STING激动剂作用于肿瘤中的Breg细胞，激活STING- IRF3信号通路，上调IL-35的表达和分泌，进而抑制NK细胞的增殖，削弱NK细胞介导的抗肿瘤杀伤功能。但联合STING激动剂和anti-IL-35抗体治疗，在小鼠模型中能显著限制抑制肿瘤生长，提高生存期，为临床克服肿瘤免疫抑制提供了新的治疗思路。
参考文献：
1 S. Li, B. Mirlekar, B.M. Johnson, W.J. Brickey, J.A. Wrobel, N. Yang, D. Song, S. Entwistle, X. Tan, M. Deng, Y. Cui, W. Li, B.G. Vincent, M. Gale, Jr., Y. Pylayeva-Gupta, J.P. Ting, STING-induced regulatory B cells compromise NK function in cancer immunity, Nature, 610 (2022) 373-380.
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M教授，博士生导师。北京大学博士，斯坦福大学博士后，欧盟Erasmus+访问学者。主要从事肿瘤分子生物学，药理学等研究，在相关领域取得了令人瞩目的成就。在Blood、Cancer Research、Oncogene、Journal of Clinical Investigation、Journal of Biological Chemistry等著名杂志已发表研究论文60多篇，IF>400。主持重点国合等项目。评审重点、重点国合、优青、杰青等不同类型项目，经验丰富。
W教授，国内某高校教授，博士生导师。作为课题负责人先后主持肠道菌群与代谢组学研究国家级课题和部省级课题多项，并先后承担多项973计划课题中有关代谢组学方面的研究课题。所带领的团队主要采用代谢组学、生态学、生物信息学、分子生物学等多种宏观与微观相结合的方法，从宿主代谢与菌群微生态交互作用的角度对胃肠道疾病、神经退行性疾病的菌-肠-脑机制进行研究。目前已发表多篇SCI论文，在肠道菌群、代谢组学数据分析策略等相关领域受到了广泛关注和认可。
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X教授，脂糖代谢实验室/重庆市重大代谢性疾病转化医学重点实验室，主任、教授、博士生导师、内分泌与代谢学科带头人；中国侨界(创新人才)贡献奖获得者；美国内分泌学会高级会员、美国生理学会、美国糖尿病协会会员；Journal of Neuroendocrinology等期刊审稿专家。近五年，主持国家级项目3项（国家自然科学基金重点项目1项、面上项目2项），省部级课题2项；发表通讯作者SCI 论文5篇；获得中华医学会科研奖励1项；培养博士1人，硕士16人。疾病转化医学重点实验室，主任、教授、博士生导师、内分泌与代谢学科带头人；重庆市生物化学与分子药理学重点实验室PI、脂糖代谢实验室实验室执行主任。中国侨界(创新人才)贡献奖获得者；美国内分泌学会高级会员、美国生理学会、美国糖尿病协会会员；Journal of Neuroendocrinology等期刊审稿专家。近五年，主持国家级项目3项（国家自然科学基金重点项目1项、面上项目2项）。
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L教授，医院病理科主任、博士生导师、病理学科带头人；重庆市中青年骨干教师，霍英东青年教师奖获得者；USCAP会员，国际老年痴呆协会会员，中国神经科学学会会员，多个国内外期刊审稿专家。近五年，主持国家级项目4项（国家自然科学基金面上项目3项、青年基金项目1项），省部级课题3项；发表通讯作者SCI 论文二十余篇；培养博士1人，硕士23人，曾作为访问学者、访问教授分别留学加拿大、美国。
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中科院研究员，中国科学院研究生院生物化学与分子生物学博士，2001-2008年任职于美国罗约拉大学医学中心神经科学部期间，曾与著名神经内分泌学专家Louis Van de Kar 教授、George Battaglia教授等合作从事神经药理学研究，共同主持和参与多项美国心脏协会和美国国家卫生部(NIH)项目。2008年回国以来主持多项国自然，评审国自然经验丰富。
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