多硫代二酮哌嗪类化合物（ETPs）是一类由真菌产生的次级代谢产物，按照跨环二硫桥在二酮哌嗪母核（DKP）的连接位置，ETPs分为两类：一类具有α, α'-二硫桥，另一类具有α, b'-二硫桥。Pretrichodermamides是一类结构多种多样的ETPs，含有独特的α, b'-二硫桥、1, 2-噁嗪环和复杂的多环结构（A–F环，图1），独特的结构赋予这类化合物重要的生物活性。化学家成功利用不同合成策略对其脱硫开环产物trichodermamides进行了全合成，然而，仅仅1, 2-噁嗪环骨架的构建就需要繁琐的步骤和苛刻的条件，严重制约了此类化合物的药用开发。因此，研究pretrichodermamides的生物合成途径是理解该类次级代谢产物结构复杂性和多样性的关键手段，对药用ETP化合物的合成生物学开发具有重要意义。

图1. 真菌中具有α, β'-二硫桥的ETP类化合物及其类似物

前期研究中，尹文兵团队在炭团木霉中鉴定了pretrichodermamide A和其生物合成基因簇（tda基因簇）（Chemical Science, 2021, 12, 4132-4138）。本研究中，作者通过基因敲除和体外蛋白反应解析了α, b'-二硫桥形成后的pretrichodermamide A生物合成步骤（图2），发现两个细胞色素P450氧化酶TdaB和TdaQ分别催化C8, C9过氧化和DKP母核中N10羟基化，再经由自发环化形成独特的1, 2-噁嗪环（B环），这一发现不同于前人报道的1, 2-噁嗪环形成机制，为1, 2-噁嗪环的酶法合成提供了新元件；细胞色素P450氧化酶TdaI催化C7'-OH的形成，甲基转移酶TdaO和TdaH分别负责C7'和C6'-羟甲基化，完成了E环的修饰；还原酶TdaD将呋喃环（D环）还原，形成C5'-OH；细胞色素P450氧化酶TdaG催化环己二烯结构中（A环）C4, C5的氧化。

图2. Pretrichodermamide A的生物合成途径

有趣的是，除了主要途径中生物合成前体，作者在基因敲除突变株中还发现大量隐秘的ETP类次级代谢产物，其中20个通过NMR进行了结构鉴定。比如，细胞色素P450氧化酶tdaI敲除后，其前体化合物6可以被TdaG、TdaD和TdaH分别催化，经由三条不同的旁支途径，形成6a–6g、15、15c以及15g（图3）；甲基转移酶tdaH被敲除后，其前体化合物8可以被TdaG和TdaD分别催化，经由两条不同的旁支途径，形成8a–8g；这些结果说明tda基因簇中不同的修饰酶均具有良好的底物选择宽泛性，然而，它们催化的位点和反应都是专一的。本研究以TdaG、TdaD和TdaH为例，通过不同底物喂养和体外蛋白反应，证实了它们的底物选择宽泛性。

图3. Pretrichodermamide A生物合成途径中ETP类化合物的结构多样性形成机制

综上所述，本研究通过解析α, b'-二硫桥形成后的pretrichodermamide A复杂生物合成步骤，鉴定了7个关键的修饰酶，发现超过20个隐秘的ETP类化合物，揭示了该类次级代谢产物结构多样性的形成机制。通过利用这些修饰酶的催化特性，可实现ETP类化合物的可预测生物合成，为该类化合物的定向挖掘及多样性创制提供了新思路。

相关工作以“Pretrichodermamide A biosynthesis reveals the hidden diversity of epidithiodiketopiperazines”为题发表在Angewandte Chemie International Edition上（doi.org/10.1002/anie.202217212）。中科院微生物所尹文兵研究员为本文通讯作者，特别研究助理范洁博士和冉火苗博士为共同第一作者，德国马尔堡大学李书明教授和中国医学科学院药物研究所胡友财研究员对本研究给予了大力支持，日本东京大学Ikuro Abe教授对本研究提出了重要指导意见。本研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金委、中国科学院从0到1原始创新项目、中国科学院战略生物资源服务网络计划生物资源衍生库项目和博士后科学基金的资助。