撰文 | 亦

#干细胞#

人多能干细胞（hiPSC）诱导分化为神经元作为一项开创性技术，为研究人类中枢神经系统（CNS）提供了极大便利，使得构建神经发育和神经系统疾病模型成为可能【1-3】。然而iPSC模型存在一些技术限制使得体外培养神经元变得很有挑战性，包括神经元异常的聚集趋势和分化神经元的不成熟，这种现象出现的一部分原因是缺乏原生胞外基质（ECM）的协同互作。因此，开发一个更像生理条件的培养环境十分重要，尤其是神经系统微环境的重塑。

ECM是微环境中一个重要的组分，其在神经元成熟，通讯及衰老中均发挥重要作用【4】。CNS中的ECM包含粘多糖，蛋白聚糖，胶原，层粘连蛋白，纤连蛋白等组分，其组织高度动态化，在不同区域不同发育阶段具有不同特征【5,6】。目前的体外神经元培养用到的ECM包括纯化或重组的蛋白，但此条件下神经元易聚集，不能很好的成熟，基质胶虽然可以有效促进神经元成熟，但是价格昂贵且具有批次效应。合成的生物材料是一个很好的替代方法，尤其是超分子聚合物，它不仅能够模仿天然结构特征，还能满足互作需求。

近日，美国西北大学生物纳米研究所的Samuel I. Stupp和Evangelos Kiskinis合作在Cell Stem Cell上发表了题为Artificial extracellular matrix scaffolds of mobile molecules enhance maturation of human stem cell-derived neurons的文章，研究开发了一种史无前例的具有运动能力的人工ECM仿生分子，它能够促进功能性神经元成熟，从而实现神经退行性疾病的成功建模。

由于层粘连蛋白α-1随着发育上调，在成年小鼠中活性显著高于新生幼鼠，IKVAV序列能与小鼠神经细胞互作，促进其黏附，生长和成熟，是很好的促进iPSC来源神经元成熟的候选分子。于是作者首先用来源于层粘连蛋白α-1链的生物活性五肽序列IKVAV功能化合成的PA纳米纤维，发现IKVAV-PA表现出与成年脊髓ECM类似的拓扑结构，他们基于对体内超分子运动的效应研究，合成了一个包含3种不同突变肽序列的小IKVAV-PA库，分别是PA1, PA2和PA3，用于探究超分子运动对神经元响应的影响。这三种IKVAV-PAs都能自组装成超分子纳米纤维，其中PA1，PA3存在分子的结晶堆积，P2流动性更强更亲水。

接下来，作者评估了PA1, PA2和PA3将层粘连蛋白相关反应转移至hiPSC来源的运动神经元（motor neurons, MNs）中的效率，发现在PA2中培养的MNs表达的跨膜受体β-1整合蛋白（ITGB1）显著高于PA1和PA3。IKVAV-ITGB1的相互作用特异调控细胞对PA的附着，IKVAV-PAs间也存在特异性，暴露于IKVAV-PA2中的MNs高表达ITGB1，这说明超分子动力学与ITGB1生物活性间存在强正相关性。进一步地，作者发现在3个KVAV-PAs中培养的MNs细胞附着和存活能力类似，TUJ1+神经元增多，IKVAV-PA2中ChAT+和ISL1/2+有丝分裂后MNs更多，迁移的速度更快，距离更远。PAs培养导致增殖的Ki67+/FOXA2+底板祖细胞减少，但不影响FOXA2+细胞的增殖能力也不会导致任何向GABA能中间神经元的偏好分化。以上说明IKVAV-PA2纳米纤维通过调节MN的附着和特化提升了神经元纯度。

将培养时间延长至61天，作者发现在PA2中培养的MNs在45天后还一直维持着ITGB1和ILK的高表达。ITGB1信号级联在人类神经元中的作用一直不清楚，作者利用质谱鉴定到相关蛋白，富集到的最显著的生物学过程都被整合素途径激活，而这些蛋白在IKVAV-PA2中表达都上调，其中最显著的就是PRDX1和PRDX5。系统性的分析发现PA2中MNs有着更大的胞体，神经元分支复杂度更高，提示PA2促进其功能成熟，生化，成像和电生理实验证明了这一点。那么IKVAV-ITGB1信号在其中起到什么作用呢？作者敲低了ITGB1的表达，发现胞内激酶，突触蛋白都显著减少，而过表达现象则相反，说明MNs对IKVAV-PA2的响应依赖ITGB1。

这一ECM平台能否用于神经退行性病理建模呢？作者利用了一个肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）细胞系模型，它在4号外显子上具有杂合错义突变，作者在IKVAV-PA2中培养突变的SOD1 MNs，发现SOD1+/4AV在培养两个月后确实在显微镜下可见细胞质的SOD1聚集和泛素蛋白包裹体，这很像遗体ALS-SOD1组织的病理情况。值得注意的是，这种蛋白聚集只在一小部分MNs中发现，且IKVAV-PA2和对照组都有，尽管IKVAV-PA2中MNs的比例更为显著。

综上，文章报道了基于多肽两亲性（peptide amphiphile, PA）超分子纳米纤维的3种人造ECMs，发现内部超分子运动强度更大的纳米纤维能增强iPSC来源的运动和皮层神经元生物活性。蛋白组学，生化及功能试验都显示高流动性的PA支架增强β1-整合素途径活性，减少聚集，增加神经元分叉和成熟的电生理活性。文章展示了仿生ECMs对于研究人类神经元发育，功能及失调的重要性。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.stem.2022.12.010

参考文献

1. Ichida, J.K., and Kiskinis, E. (2015). Probing disorders of the nervous systemusing reprogramming approaches. EMBO J. 34, 1456–1477. https://doi.org/10.15252/embj.201591267.

2. Wu, Y.Y., Chiu, F.L., Yeh, C.S., and Kuo, H.C. (2019). Opportunities andchallenges for the use of induced pluripotent stem cells in modellingneurodegenerative disease. Open Biol. 9, 180177. https://doi.org/10.1098/rsob.180177.

3. Soliman, M.A., Aboharb, F., Zeltner, N., and Studer, L. (2017). Pluripotentstem cells in neuropsychiatric disorders. Mol. Psychiatry 22, 1241–1249.https://doi.org/10.1038/mp.2017.40.

4. Wagers, A.J. (2012). The stem cell niche in regenerative medicine. Cell Stem Cell 10, 362–369. https://doi.org/10.1016/j.stem.2012.02.018.

5. Sood, D., Cairns, D.M., Dabbi, J.M., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K.,Black, L.D., 3rd, Santaniello, S., and Kaplan, D.L. (2019). Functionalmaturation of human neural stem cells in a 3D bioengineered brain modelenriched with fetal brain-derived matrix. Sci. Rep. 9, 17874. https://doi.org/10.1038/s41598-019-54248-1.

6. Dauth, S., Grevesse, T., Pantazopoulos, H., Campbell, P.H., Maoz, B.M.,Berretta, S., and Parker, K.K. (2016). Extracellular matrix protein expressionis brain region dependent. J. Comp. Neurol. 524, 1309–1336.https://doi.org/10.1002/cne.23965.

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