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*本文首发于“纳米酶Nanozymes”公众号，2022年3月20日

*编辑：俞纪元

酶级联反应是指一种酶的酶促反应激发另一种酶进行催化反应的过程。由于级联作用可以提高酶的反应活性、避免反应中间体的不稳定并放大输出信号，使得其在分析化学领域有着独特的应用优势。而天然酶较低的稳定性和高昂的价格是制约酶级联反应广泛应用的关键因素，目前天然酶的固定化或以模拟酶代替天然酶是最常用的两种改进策略。此外，目前应用于检测领域的酶级联反应多为双酶级联反应体系，而三酶级联反应体系多聚焦于酶固定、机理和性能研究。如何在避免复杂的酶固定化过程的同时，构建具有优异分析性能的三酶级联反应传感体系是本研究的出发点。

济南大学材料科学与工程学院逯一中教授团队和中科院长春应化所孙健副研究员通过简便的溶剂热法一步合成了具有类过氧化物酶活性的各种过渡金属-氮-碳材料（f-MMN）。并将催化性能最优的f-FeNC与葡萄糖氧化酶（GOx）、α-葡糖苷酶（α-Glu）相结合，构建二酶和三酶级联反应体系，实现了对葡萄糖和α-Glu的灵敏检测。同时，该体系可用于筛选α-Glu抑制剂（AGIs）作为抗糖尿病和抗病毒药物。

图1 各种f-MNN的催化活性对比和构建的酶级联反应体系示意图

研究内容

首先，以甲酰胺和金属盐为前驱体，经180 ℃反应12 h，获得各种f-MNC。通过金属元素掺杂，棒状的f-NC转化为无定形的纳米片层材料（图2B-C）。f-FeNC中无明显纳米晶颗粒（图2D），厚度约为1.5 nm（图2D），各元素在整个材料中均匀分布（图2F）。尽管形貌发生变化，f-FeNC的XRD图谱与f-NC相似，仅在2θ=27º处具有一个尖锐碳氮相的(022)特征峰，无金属纳米颗粒和碳化铁纳米颗粒的特征峰（图3A）。Fe高分辨XPS图谱表明Fe以氧化态而非Fe(0)形式存在（图3C），间接表明Fe以配位形式孤立分散。氮元素主要以吡咯氮和吡啶氮的形式存在（图3D）。C 1s精细峰和FTIR表明f-NC和f-FeNC材料表面含有C=C、C=N、C-N和N-H等官能团（图3E-F）。

图2（A）f-NC和（B-C）f-FeNC的TEM。F-FeNC的（D）AFM和（E–I）elemental mappings图谱。

图3 f-NC和f-FeNC的（A）XRD图和（B）XPS图。（C）f-FeNC的Fe 2p XPS图谱。f-NC和f-FeNC的（D）N 1s XPS图、（E）C 1s XPS图和（F）FTIR。

接着，作者以TMB、OPD和ABTS为显色底物验证了f-MNC的类过氧化物酶活性（图4A-B），且各种f-MNC活性不同（图4C）。通过催化反应动力学实验获得各催化剂的Km和Vmax（图4D-E），并由此进一步计算催化常数（Kcat）和催化效率（Kcat/Km），获得各种f-MNC的催化活性顺序关系：f-FeNC > f-CuNC> f-MnNC> f-CoNC > f-ZnNC。该顺序与比活性结果相一致（图4F）。此外，作者以f-FeNC为例，通过SCN-毒化、荧光探针法和EPR表征证明催化机理为活性中心Fe-N4引发的Fenton反应。

图4（A）各显色底物-H2O2体系加入f-FeNC前后的比色信号变化。（B）TMB与各物质共存时的比色信号变化。（C）TMB-H2O2与各种f-MNC反应后比色信号的变化。（D）TMB和（E）H2O2为底物时的反应动力学。（F）各种f-MNC的比活性。

基于f-FeNC优异的类过氧化物酶活性，作者将其与GOx联用构建双酶级联反应体系：葡萄糖在GOx催化作用下，氧化水解产生葡萄糖酸和H2O2；产生的H2O2进而参与f-FeNC催化的显色反应。比色信号强度与H2O2浓度正相关，而H2O2浓度由葡萄糖浓度决定，进而能够实现对血清中葡萄糖的检测（图5）。f-FeNC/TMB显色体系还被证实可以与D-氨基端/D-氨基酸氧化酶等其它体系联用，实现对多种疾病标志物的检测。

图5 基于级联反应检测葡萄糖的（A）原理图、（B）可行性和（C）特异性。（D）吸收光谱和（E）吸光度变化与葡萄糖浓度的关系。（E）血清中葡萄糖检测结果。

作者在上述双酶级联反应体系中引入α-Glu，以α-D吡喃葡萄糖苷(NPGlu)、蔗糖、麦芽糖等多种生物分子作为α-Glu底物构建三酶级联反应，实现了对α-Glu活性的检测。以NPGlu为底物时构建的反应体系为例，检测机理图和可行性如图6A-B所示。检测的线性范围为0.005–0.04 U/mL和0.04–0.1 U/mL，检出限为0.27 mU/mL（图6C-D），灵敏度几乎高于目前报道的所有α-Glu活性检测方法，且该检测体系具有良好的特异性（图6E）。

图6 基于级联反应检测α-Glu的（A）原理图和（B）可行性。（C）吸收光谱和（D）吸光度变化与a-Glu活性之间的关系。（E）α-Glu检测的选择性。

构建的a-Glu/GOx/f-FeNC体系能够进一步用于筛选还原性较弱或无还原性的AGIs，如阿卡波糖、伏格列波糖和齐墩果酸等（图7A）。作者以伏格列波糖为例，进一步考察了抑制剂对a-Glu的抑制效率（图7B）。

图7（A）不同AGIs对H2O2/f-FeNC/TMB、GOx/glucose/f-FeNC/TMB和NPGlu/α-Glu/GOx/f-FeNC/TMB体系的影响。（B）Voglibose对α-Glu活性的抑制效果。

结论与展望

本文开发了一种简单、通用的过氧化物酶模拟物f-MNC的制备方法，并对比了各种过渡金属元素对f-MNC催化效率的影响，详细探究了催化机理。基于f-FeNC优异的类过氧化物酶活性，成功构建了通用的多酶级联反应比色分析平台：将f-FeNC与GOx或α-Glu/GOx相结合，实现对H2O2、葡萄糖、α-Glu和AGIs的比色检测。同时该检测体系有望用于分析其它生成或消耗H2O2的生物分子以及能催化葡萄糖生成反应的生物酶等，亦能够扩展应用到其它类型的底物/α-Glu体系。

相关论文近期以“Multienzyme Cascades Based on Highly Efficient Metal–Nitrogen–Carbon Nanozymes for Construction of Versatile Bioassays”为题发表在国际知名期刊Analytical Chemistry上（https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.analchem.1c04018）。该论文的第一作者为济南大学张成会博士后和陈传霞副教授，通讯作者为济南大学逯一中教授和长春应化所孙健副研究员。

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撰稿｜陈传霞

审阅｜刘淑杰

编辑｜俞纪元