撰文 | 望夜

抗体的多样性极高，据估计人体B细胞受体（BCR）库的规模可达1012数量级【1】。每种BCR有其独特构象及由抗体可变区（V）基因编码的抗原互补决定区（CDR）。抗体的多样性尤其体现在高度变异的CDRH3，常决定对抗原的识别【2】。某些高度变异的病毒，如人类免疫缺陷病毒（HIV）和流感病毒（IAV），可建立复杂的免疫优势等级（immunodominance hierarchies），阻碍靶向其易感的保守表位的广谱中和抗体（bnAb）的可重复扩展【3】，导致CDRH3-主导的抗原识别无法均匀触及整个抗原空间。另有一些人源bnAb依赖V基因编码的CDR结合抗原，产生可遗传重复或“公共”发育途径【4】，催生出种系刺激疫苗的开发，如最近报道的IAV疫苗设计【5】，通过理性设计的抗原选择性扩增某一谱系的bnAb。

依照系统发育关系和抗原特征，IAV可分为两个群（1和2）。IAV囊膜表面的血凝素（HA）是典型的I型病毒蛋白，其结构包括可变的头部区和相对不变的靠近囊膜的茎部区，后者带有一个保守的疏水沟槽可结合群特异的bnAb【6】。但在病毒感染或常规HA疫苗接种后，茎部区bnAb通常是免疫隐性的，需要理性设计的免疫原方可诱导出高滴度的茎部区bnAb。

人体中确实存在一类特异性靶向1群IAV HA茎部区表位的bnAb，由抗体VH基因IGHV1-69编码的CDRH2负责识别；非人灵长类中也有靶向该表位的类似VH基因。IGHV1-69具有多态性，编码的等位基因变异分为两类，区别在于CDRH2的54位为苯丙氨酸（F54）或亮氨酸（L54），该尖端关键残基负责与HA茎部区形成初始接触【7】。大部分人源IGHV1-69茎部区bnAb源于F54等位基因，当然在人体中也存在L54型茎部区bnAb，尽管其在B细胞记忆中被显著抑制，且在血液中的滴度更低【7】。

为系统研究IGHV1-69基因在应对IAV感染中的差异，2022年8月10日，美国麻省总医院Ragon研究所的Daniel Lingwood团队在Immunity杂志上发表了文章Allelic polymorphism controls autoreactivity and vaccine elicitation of human broadly neutralizing antibodies against influenza virus。研究人员使用人源化小鼠探究两种等位基因在种系扩展中的差异，发现尽管它们都编码bnAb前体，但使用仅含茎部区的纳米颗粒疫苗免疫小鼠时，只有F54 IGHV1-69可产生有保护效果的血清bnAb；L54 IGHV1-69无法产生保护效果，编码无能的B细胞或自身反应性的茎部区抗体，无法产生免疫记忆。作者发现人源的茎部区抗体也显示L54依赖的自身反应性。

作者首先在公共数据库中检索发现L54等位基因的使用频率约为13%，且在不同人种间存在差异：对纯合子而言，各人口族裔显著地偏向使用F54/F54，但南非人更偏向带有L54/L54；杂合子中，包括南非在内的大多数人至少带有一个拷贝的F54。

那么两种抗体在表位识别上是否存在差异？F54 IGHV1-69茎部区bnAb此前已有结构报道【8】，确认主要通过CDRH2上疏水的I53和F54及CDRH3上的酪氨酸与HA茎部的Kabat位点（98-100）形成氢键相互作用。本文中，作者通过冷冻电镜解析两株不同供者来源的L54茎部区bnAb（310-39G10和310-63E6）结合HA的结构，发现两株抗体的轻链几乎不参与结合，主要通过VH结合配体：310-39G10主要通过CDRH2上的I53和CDRH3上的Y98参与结合；310-63E6的表位范围更广，重链的CDRH1、FR3和CDRH3均参与结合。结构对比发现，IGHV1-69抗体的结合角度是相似的，彼此重叠的部分正好是L54、F54识别的位点。

接着，作者使用带有纯合HC2基因座的人源化小鼠，评估疫苗免疫后的抗体产生差异。HC2将抗体限定于特定的VH基因，同时保证抗体CDRH3产生与人体中类似的多样性【9】。在本研究中，VH被限定于IGHV1-69*01 (F54) 或IGHV1-69*09 (L54)，这是F54和L54等位基因常用形式。利用深度测序验证初始IgM BCR池，反映抗体CDRH3的长度分布和氨基酸组成。然后，作者评估两种等位基因产生在靶抗体的能力，使用3种IGHV1-69基因型的HC2小鼠——纯合子F54/F54、L54/L54，及杂合子F54/L54。通过特异识别F54基序的G6抗体染色，确认F54/F54小鼠中的BCR全部为G6+型，F54/L54小鼠中50%为G6+，而L54/L54不含有G6+BCR。随后，使用探针检测前体B细胞组成，发现F54 IGHV1-69的使用频率和数量都显著提升，尽管提升幅度较L54小得多。说明在靶频率的差异与非正常B细胞和T细胞的数目没有相关性，是由功能性B细胞亚群维持的。

接下来，作者使用仅含HA茎部区的纳米颗粒抗原SS-np免疫HC2小鼠，该抗原可在F54/F54基因型动物中诱导产生广谱的保护性反应【10】。作者发现，仅带有F54等位基因的小鼠可产生靶向bnAb表位的血清抗体，且可中和多种1群的IAV毒株，包括与免疫抗原同种的NC99 H1N1毒株、同亚型其他毒株（H1N1大流行毒株CA09）、及另一亚型毒株（禽源H5N1 VN04）。杂合子小鼠产生的bnAb中和活性降低，L54/L54小鼠中的bnAb中和活性最低。换用致死性H5N1禽源流感病毒攻毒，也可产生F54依赖的疫苗保护效果，而带有L54基因型时保护效果显著降低。

紧接着，作者发现L54型抗体比F54型抗体显示出更高的多反应性（polyreactivity），表现在与双链DNA、人源重组胰岛素和细菌LPS的反应水平升高。由于抗磷脂类抗体往往具备自身免疫性（autoreactivity）【11】，作者检测抗体对鞘磷脂、POPC（1-棕榈-2-油酰-3-磷酸胆碱）和心磷脂的反应能力，发现L54抗体对这些脂质的结合能力都显著上升，对Hep-2细胞的结合能力也增强。而将L54的差异氨基酸突变回F54（L54F、L54F/R49G、L54F/R49G/I56T），可削弱其多反应性和自身反应性。此外，作者还从人体外周血单核细胞（PBMC）中分离出F54和L54型在靶抗体，发现L54型抗体同样表现出广谱的多反应性及自身反应能力。

L54抗体的自身反应性是如何获得的？作者首先排除由于HA茎部区糖基化修饰诱导的可能。对SS-np进行去糖基化处理后，作者发现L54抗体的反应性增强，说明茎部区糖修饰自身不足以支持多反应性和自身反应性。其次研究B细胞发育过程的影响，分别评估骨髓中的未成熟B细胞、外周的过渡性和成熟B细胞。作者发现L54/L54和F54/F54基因型小鼠中各阶段的B细胞数目相当，但L54 B细胞表面IgM减少约50%，这种减少可以追溯至骨髓，在外周的过渡性T1、T2和T3亚群中持续存在，并最终导致L54 B细胞中受体触发减少。此外，研究显示，当抗体重链出现自身反应特征时，lambda链（IgL）的使用频率显著升高以改变受体多样性，促进免疫耐受【12】，作者在小鼠骨髓和脾的L54 B细胞中观察到IgL使用率升高。

那么疫苗扩增的L54 B细胞最终命运如何？作者继续检测SS-np疫苗免疫小鼠后抗原特异性B细胞的扩增情况，使用H1-HA和H5-HA作为探针进行流式细胞分析，发现F54基因型小鼠的B细胞可以扩增，L54/L54小鼠的B细胞起初可以扩增，但随后被清除掉。如果引入一条F54等位基因，即在F54/L54杂合小鼠中，茎部区特异B细胞的积累获得重建。进一步观察发现，小鼠每次接触SS-np时B细胞均会进入生发中心（GC），但不会在此积累，仅带有F54基因型的记忆B细胞获得积累，而L54/L54小鼠未能形成记忆B细胞。作者发现L54型克隆通过体细胞超突变（SHM）积累突变，增强其多反应性和自身反应性，暗示在外周存在一种免疫耐受和清除的基础。

记忆B细胞的清除似乎可以解释L54/L54小鼠中观察到的抗体二次应答减少的现象。为此，作者使用不同长度的HA抗原接续免疫IGHV1-69 HC2小鼠，包括全长HA的HA-np、SS-np、及仅包括三聚体受体结合区（RBD）的RBD-np，结果显示包含茎部区的免疫原（HA-np或SS-np）产生的IgG抗体滴度显著降低。

最后，作者尝试可否重建L54型的抗体反应。首先分析L54抗体上介导自身反应性的位点（L54/R49/I56），发现在前述L54抗体复合物结构中，这些位点或者发生突变或者不参与结合配体，即这些位点不影响抗体对1群bnAb表位的结合。而上述位点的变异也说明L54茎部区抗体在这些位点上可适应一系列的氨基酸突变，那么是否有些突变可以支持克隆赎回（clonal redemption）？答案是肯定的，前述310-39G10和310-63E6抗体就失去自身反应性，此外SHM也可消除L54编码的自身反应性。因此，尽管L54 IGHV1-69可编码具有多反应性和自身反应性的BCR，但可以通过生化方法将这类抗体其分离去除，且在某些情况下，可用SHM“拯救”这一谱系。作者进一步还发现，使用抗体阻断免疫调节受体CTLA-4可以重建L54的抗体对HA茎部区的二次应答。

回顾全文，作者利用人源化小鼠分析IGHV1-69诱导bnAb产生的过程，发现F54和L54型等位基因均编码针对流感病毒的人源bnAb；但仅F54型可产生疫苗扩增的高滴度bnAb。L54型IGHV1-69产生的是多反应性和自身反应性的B细胞，会被清除而无法产生记忆B细胞。免疫检查点抑制剂可以重建L54型IGHV1-69基因的抗体反应。因此，IGHV1-69多态性决定流感病毒bnAb的耐受性和疫苗可扩展性。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2022.07.006

制版人：十一

参考文献

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12. Luning Prak, E.T., et al. (2011). B cell receptor editing in tolerance and autoimmunity. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1217, 96–121.

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