今天推送的文章发表在ACS Catalysis的“Active-Site Engineering Switches Carbohydrate Regiospecificity in a Fungal Copper Radical Oxidase”，通讯作者为新加坡国立大学化学与生物分子工程系的李志教授。

铜自由基氧化酶 (CRO) 在碳水化合物活性酶 (CAZy) 数据库中包含辅助活性家族 5 (AA5)，其中它们分为两个主要的系统发育亚家族（AA5_1与AA5_2）。AA5_1包括少数乙二醛氧化酶 (E.C. 1.2.3.15)，它们催化同名醛（或其水合物）氧化成相应的酸。

AA5_2包括原型半乳糖6-氧化酶 (GalOx, E.C. 1.1.3.9)，以及最近发现的一些醇氧化酶 (AlcOx, E.C. 1.1.3.13) 和芳基醇氧化酶 (AAO, E.C. 1.1.3.7 )，能够将它们各自底物的伯醇转化为相应的醛。AA5成员的由单核铜中心介导催化，该中心由独特的交联酪氨酸-半胱氨酸自由基辅因子协调；O₂作为最终电子受体生成H₂O₂作为副产物。

在生物催化和生物技术应用领域，CRO以其独特的催化性能和底物范围一直受到关注。作者最近报道了来自禾本科炭疽菌CgrAAO的AA5_2 CRO的催化特性和三级结构，具有特别高的芳基醇氧化酶活性，对在非还原端含有末端半乳糖 (t-Gal) 残基的半乳糖和二糖和三糖也有适度活性。三维结构分析揭示了在CgrAAO酶中残基Trp554-Gly564的活性位点附近具有明显的延伸loop，其碱基由保守的二硫键形成（图1），该loop的长度与蛋白质序列相似性网络 (SSN) 簇相关，并且在大多数AA5_2 成员中通常较短。

在本研究中作者探索了该loop对CgrAAO底物特异性的作用。截断loop不仅降低了对末端含半乳糖的糖类的活性，而且还使酶对多种碳水化合物的C-6区域选择性活性转变为C-1的区域选择性。

鉴定CgrAAO中的底物结合决定簇

在CgrAAO三级结构 (PDB ID 6RYV)中，Cys553和Cys565之间存在二硫键，在活性位点附近形成了一个独特的、延伸的11个氨基酸组成的looploop（图1）。通过对623个AA5_2催化区域的多序列比对评估这两个半胱氨酸的保守性和loop的长度，将此信息映射到SSN上揭示了亚组与loop长度之间的相关性（图1A，B）。

5个亚组（总共92个序列）缺乏形成二硫键的两个半胱氨酸。有一半的序列，包括各种表征的半乳糖-6-氧化酶、一般醇氧化酶和芳基醇氧化酶，在loop内具有两个或三个残基。包括特征性棉子糖氧化酶(RafOx)在内的17个AA5_2成员具有五个残基长的loop。其余的AA5_2成员具有10-14个残基的loop，其中大多数具有11个残基的loop，如CgrAAO（图1）。

由于三个典型的AA5成员（包括CgrAAO）没有底物或产物复合物的晶体结构数据，作者通过活性位点中蜜二糖 (Galpα1-6Glcp)、棉子糖 (Galpα1-6Glcpα1-2βFru)和乳糖 (Galpα1-4Glcp)的计算对接评估了延长的loop在CgrAAO中的作用（PDB ID 6RYV）。所有配体都具有合理的结合姿势，并且在与Trp554的合理氢键距离内。此外，棉子糖吡喃葡萄糖基与Trp554具有潜在的π堆叠相互作用，同时与Gln556形成额外的氢键，两个残基都位于扩展loop上（图2）。这些分析表明二硫键之间的延长loop增加了野生型CgrAAO对较长末端半乳糖基化糖的特异性（表1）。

CgrAAO-Δloop具有改良的底物特异性曲线

为了更详细地分析这种结构的功能作用，作者创建了一个截短的loop突变体CgrAAO-Δloop，在两个半胱氨酸之间仅含有两个氨基酸（野生型有11个）（图1），在毕赤酵母中表达并纯化野生型酶和CgrAAO-Δloop。CgrAAO-Δloop突变体保留了所有预测的野生型 N-糖基化位点（N309、N386 和 N644，对应于CgrAAO-Δloop中的N309、N386和N635）。

尽管未能成功获得CgrAAO-Δloop突变体的晶体结果，但结构同源性模型表明，loop缺失不会改变活性位点铜配体的位置。随后使用AA5酶的一系列碳水化合物、其他醇和醛底物测试了野生型酶和CgrAAO-Δloop的活性。Michaelis-Menten 动力学分析表明，CgrAAO-Δloop具有与野生型酶相当的底物范围（图3，表1）。对于检测的一系列底物来说，loop突变体的整体底物特异性没有重大变化，芳基醇仍然是CgrAAO-Δloop的最佳底物。

与野生型酶相比，以 HMF作为高活性参考底物时，CgrAAO-Δloop的pH速率曲线和温度稳定性也基本不变。然而，CgrAAO-Δloop对某些碳水化合物的活性有明显的变化。CgrAAO-Δloop对含 t-Gal的二糖和三糖类似物蜜二糖和棉子糖的活性大大降低了，表现为K_m值的增加。这些结果与分子对接结果一致，表明野生型酶的扩展loop有利于与较长的碳水化合物底物结合（图2）。相反，野生型酶对半乳糖的初始速度和底物浓度表现出严格的线性关系，而CgrAAO-Δloop表现出曲线，表明半乳糖与CgrAAO-Δloop中活性位点的相互作用有所改善。同样，与野生型酶相比，CgrAAO-Δloop对乳糖的Km值降低（表1）。另外，CgrAAO-Δloop突变体获得了对 d-葡萄糖、二葡萄糖苷麦芽糖、甲基乙二醛和 2,5-二甲酰基呋喃 (DFF)的活性（图3、表1）。

产物分析揭示CgrAAO-Δloop对碳水化合物区域选择性的改变

典型的野生型AA5_2酶，比如原型FgrGalOx，能够将D-半乳糖和D-吡喃半乳糖苷的C-6上的伯羟基氧化成相应的醛（通常水合形成偕二醇）。一些AA5_2成员可以氧化非碳水化合物烷基和芳基醇上的伯羟基。为了充分了解CgrAAO-Δloop突变体改变的底物特异性，作者使用NMR技术对产物进行了分析。结果表明，CgrAAO-WT与半乳糖的反应 （图4和图5化合物1）仅产生与C6氧化半乳糖α和β端基异构体的水合形式相对应的偕二醇（图4和图5，化合物7），转化率为32%。

与CgrAAO-WT不同，CgrAAO-Δloop与半乳糖反应仅产生少量的C6氧化产物（偕二醇），转化率为6%。此外，CgrAAO-Δloop还催化半乳糖形成了半乳糖酸（图4），是CgrAAO-Δloop氧化半乳糖的主要产物（22%转化率），因此野生型酶的专有C-6区域选择性转变为截短loop突变体中的主要C-1区域选择性。与其他AA5酶一样，野生型CgrAAO对D-葡萄糖没有活性（图3，表1）。与D-半乳糖类似，CgrAAO-Δloop能在C-1处氧化D-葡萄糖（图5，化合物2），仅产生D-葡萄糖酸（图5，化合物9），底物转化率为17%。CgrAAO-Δloop对甲基α-D-吡喃葡萄糖苷和甲基β-D-吡喃葡萄糖苷的反应，进一步证明了这种区域选择性。

CgrAAO-Δloop突变体对单糖的C-1区域特异性氧化可以用底物二糖乳糖、蜜二糖和麦芽糖（图 5，化合物4-6）体现。野生型CgrAAO主要将乳糖 (Galpβ1-4Glcp)和蜜二糖 (Galpα1-6Glcp)的吡喃半乳糖基残基的C6氧化为相应的水合醛（图5，化合物11和13）。相比之下，CgrAAO-Δloop突变体通过氧化吡喃葡萄糖基loop的C-1产生乳糖酸（图 5，化合物12）和蜜糖酸（图5，化合物14）。HMF是AA5 CRO的典型芳基醇底物，其氧化衍生物是重要的生物质衍生原料。先前研究表明，二醛DFF是野生型CgrAAO氧化HMF的唯一产物。与野生型相似，CgrAAO-Δloop与HMF的反应仅产生DFF（表1）；然而，CgrAAO-Δloop 能够将DFF继续转化为甲酰基呋喃甲酸（FFCA）和2,5-呋喃二甲酸（FDCA）。