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Transamination-Like Reaction Catalyzed by Leucine Dehydrogenase for Efficient Co-Synthesis of α-Amino Acids and α-Keto Acids

”通讯作者为江南大学生物技术学院酿造微生物学与应用酶学实验室的穆晓清副教授。

α-氨基酸和α-酮酸是在食品、农业和制药工业中合成几种有商业价值的产品的通用构件。该研究成功构建了一种由亮氨酸脱氢酶催化的新型转氨化样反应，用于α-氨基酸和α-酮酸的高效酶促共合成。在这种反应模式下，α-酮酸底物被还原，α-氨基酸底物同时被酶氧化，而不需要额外的辅酶再生系统。在热力学上不利的氧化反应是由还原反应驱动的。采用12种不同的底物组合来评价生物催化反应的效率，并观察到底物转化率的显著变化，这随后可以用酶动力学参数的差异来解释。在最佳反应条件下，与所选模型底物2-氧丁酸和L-亮氨酸的反应转化率达到90.3%，总周转率较高，为9.0×10⁶。此外，通过调整两种底物的添加比例，实现了完全的转化。所构建的反应模式可应用于其他氨基酸脱氢酶，合成更广泛的有价值的产物。

亮氨酸脱氢酶（LDH）对α-氨基酸和α-酮酸的底物特异性

为了描述LDH的底物特异性，选择α-酮酸（（4-甲基-2-氧戊酸：1a、3-甲基-2-氧丁酸：2a、2-氧丁酸：3a、3、3-二甲基-2-氧丁酸：4a、2-氧丙酸：5a、2-氧-3-苯丙酸：6a）和α-氨基酸（L-亮氨酸：1b、L-缬氨酸：2b、L-2-氨基丁酸：3b、L-叔亮氨酸：4b、L-丙氨酸：5b、低苯丙氨酸：6b）进行催化活性研究。与之前的文献报道一致，LDH在还原方向上对脂肪族α-氨基酸1a到5a具有可测量的活性，而对芳香族2-oxo-3-苯基丙酸没有活性(6a)（图2）。此外，LDH可逆地催化一系列脂肪族α-酮酸(1b到5b)转化为α-氨基酸，（图2）作为一种转氨酶。然而，α-氨基转移酶通常需要氨基酸作为氨基供体来还原α-酮酸，而氨基转移反应的转化率受到热力学平衡的限制。相比之下，LDH可以利用廉价和容易获得的氨作为氨基供体来催化α-酮酸的还原胺化，具有高原子经济。

LDH催化的单步氧化还原反应的转化

反应过程中的转化程度不仅取决于LDH酶的比活性，而且还受到反应条件的影响。研究了5种α-酮酸的还原反应和相应的5种α-氨基酸的氧化反应。如图3所示，LDH催化的单步氧化反应的转化率较低，不超过约3%，而单步还原反应的转化率约为70%。还原反应的转化率是氧化脱氨反应的近23倍，说明LDH有利于α-酮酸对相应的α-氨基酸的还原胺化。

氨基供体和受体不同组合对转化率的影响

虽然LDH对α-氨基酸的活性和转化率较低，但通过偶联高效辅酶再生系统，该酶可以氧化氨基酸生成酮酸。基于转氨反应的机理，以酮酸还原为偶联辅酶再生体系，建立了LDH催化的底物偶联类转氨反应。还原胺化的辅酶依赖性与氧化脱氨的辅酶依赖性互补，为辅酶的持续再生提供了一个简单的途径。

LDH的底物特异性和单步氧化或还原反应的转化，选择酮酸底物(1a、2a、3a和4a)和相应的氨基酸底物(1b、2b、3b和4b)设计12种氨基供体和受体组合。采用不同底物组合的反应的转化率如图4所示。在与还原胺化反应偶联时，大部分氧化反应的转化率比单步反应有不同程度的增加。这些结果证实了利用LDH催化的类转氨酰胺反应同时合成α-氨基酸和α-酮酸的可行性。

当4b参与反应时，所有酮酸底物(1a、2a、3a)的转化率均有显著提高。4b的转化率达到77.8%，比单步氧化反应的转化率高出77倍。相比之下，当4a参与反应时，不同氨基酸底物(1b、2b、3b)的转化率没有明显增加。然而，4b的转化率达到了22.6%，仍是单步氧化反应的7.8倍。

不同底物上LDH的动力学参数

为探讨不同底物组合转化率差异的原因，研究了LDH在还原1a、2a、3a、4a和1b、2b、3b、4b时的动力学参数。如表一所示，kcat/Km不同酮酸的LDH在还原胺化反应中 1a>2a>3a>4a降低，kcat/Km在氧化脱氨反应中相应的氨基酸的相似序列中减少。kcat/Km还原反应的值比氧化反应的值高2-3个数量级，这解释了为什么LDH有利于催化还原胺化反应。不同还原或氧化底物的动力学参数以及采用不同底物组合的反应的转化表明，转氨酶样反应遵循以下规则。

如图1所示，转氨酶样反应的转化效率由k的比值决定。kcat/Km的还原反应底物 （A） 和 kcat/Km的还原产物对应于氧化反应底物（D）。更高的比率导致更高的转换效率。如果从A到B的反应中的催化效率大于从D到C的反应中的催化效率，则底物A优先结合NADH辅酶以防止产物D的还原反应。

类转氨反应条件的优化

通过对转化率和产物值的综合考虑，研究了2-氧丁酸(3a）和L-亮氨酸（1b)的底物组合作为底物模式反应。优化了辅酶浓度、NH4+浓度、pH值、底物浓度等反应条件。

NAD+浓度对类转氨反应体系转化的影响如（图5A）所示。当辅酶浓度在0.01µM~10µM之间变化时，反应的TTN值急剧下降，而3a和1b的转化率没有明显变化。当辅酶浓度为0.01µM时，3a和1b的转化率分别达到58.8%和65.6%，高TTN为5.9×10⁵。这表明辅酶的浓度对类转氨反应的最终转化的影响微不足道，因为辅酶的氧化形式和还原形式都会被氧化或还原反应迅速消耗。因此，在类转氨反应中建立了一个辅酶自循环。

研究NH4+的作用浓度从2 mM到10 mM显示NH4+对转氨酶样反应几乎没有影响（图5B）。NH4+是氧化反应的产物，在转氨酶样反应期间可用作氨基供体。因此，确定2 mM作为转氨反应的最佳NH4+浓度。

反应pH值从7.0到11.0变化，以评价其对转化的影响。如（图5C）所示，转化率随着pH值从7.0增加到9.0的增加而增加。在pH 9.0下，3a和1b分别实现了73.2%和72.3%的最大转化率。转化率下降到pH 9.0以上，这可能是由于酶变性和在高pH值下失活。因此，选择pH 9.0作为转氨反应的最佳pH值。

如图5D所示，在20-100 mM范围内研究了初始底物浓度对转化的影响。3a和1b的转化率分别达到83.4%和81.5%的最大值，初始底物浓度为100 mM。当使用120 mM的底物浓度时，转化率降低，表明高底物浓度抑制了反应。因此，选择100 mM作为进一步转氨酶样反应的最佳底物浓度。

在最佳反应条件下， 初始反应速率相当高， 前2 h转化率达到75%.随后，反应减慢，1b和3a的最终转化率分别达到90.3%和89.5%。此外，TTN从5.9×10⁵至 为9.0×10⁶与之前的反应相比。然而，即使在延长反应时间时，转化率也没有达到100%，这可能是由于热力学平衡的影响（图6）。

通过调节底物比来改变反应平衡

即使对反应条件进行优化，仍未实现完全转化。调整底物比例是双底物反应等双底物反应中提高反应转化率的常用策略。因此，作者测试了两种底物的不同比例，以努力改变反应平衡，进一步提高转化率。如图7所示，当1b与3a的摩尔比分别为1：8和6：1时，1b和3a的转化率分别达到100%。这些结果表明，调节底物比也能有效地提高转氨反应的转化率。

整理：高放

DOI.org/10.3390/molecules26237287