大家好，今天推送的文章是来自Biochemistry的“Structure-Guided Design of Formate Dehydrogenase for Regeneration of a Non-Natural Redox Cofactor”通讯作者为中国科学院大连化学物理研究所的赵宗保研究员 。

甲酸脱氢酶(FDH)广泛用于还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的再生。但因为NCD的还原形式NCDH必须得到有效再生，所以利用烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)作为一种非自然氧化还原辅助因子仍然具有挑战性。作者根据一种假单菌Pseudomonas sp. 101的FDH(pseFDH)和NAD-pseFDH复合物的结构信息，采用半理性策略设计突变文库，筛选与NCD相关的活性。活性最高的突变体活性提高了3700倍，并且实现了从NAD到NCD的辅助因子偏好转换。

甲酸脱氢酶（FDH）在环境温度和压力下催化甲酸氧化成CO2 ，伴随着NAD还原成NADH。当使用外部电子源时，FDH也可用于CO2固定，以合成富含能量的化学品，目前已经开发了更多使用FDH作为关键成分的催化系统。由于甲酸盐很容易在商业规模上获得，并且可以使用CO2合成，因此FDH显示出NADH再生的巨大潜力，并已成功用于生物系统。利用FDH进行NADH再生可以改变反应平衡，从而驱动热力学上生成限制性产物。

首先，作者对pseFDH的晶体结构进行了结构分析，根据迭代饱和突变（ISM）策略被选择来构建靶向文库，在与NAD的腺嘌呤部分距离为4Å 的范围内选取了8个潜在位点后，构建了这些残基的单位点饱和诱变文库，并在0.1mM NCD的条件下，根据耦合酶分析筛选粗酶提取物。筛选出两种对NCD具有更好的选择性的突变体FDH_A199C与FDH_ C256I。后以其作为模板，在上述8个潜在位点进行第二轮突变，获得对NCD的选择性进一步提高的突变体FDH_A199C/S381I和FDH_ A199C/S381N，这表明残基S381对辅因子结合很重要。然后对每个双突变体作为模板进行ISM策略分析，发现突变体FDH_A199C/E261P/S381I对NCD的偏好比pseFDH增加了228倍。

同源性建模结果表明， E261P的突变导致了不利于NAD结合的结构变化；突变S381I和E261P引入了与NCD的胞嘧啶部分的疏水相互作用；残基C256位于腺嘌呤结合袋内的环上并在辅因子结合中起关键作用。因此，作者决定在C256的同一侧引入额外的疏水相互作用，采用三重编码饱和突变（TSCM）的方法将V198突变为V/I/L/F198，后对突变体进行活性筛选得到了一个对NAD的活性显著降低，但对NCD的活性增加的三突变体FDH_C256I/E261P/S381I催化偏好增加733倍（表1）。

后续的同源建模得出突变C256I导致阻碍NAD进入的辅因子结合袋体积减小。此外，I256的侧链与NCD的胞嘧啶部分提供了额外的疏水性相互作用，导致对NCD的结合亲和力增加。pseFDH–NAD复合物的结构表明，E261与NAD腺嘌呤部分的-NH2基团形成氢键，S381的羟基与NAD的磷酸基团形成氢链（如下图A）。E261P的突变直接破坏了这些与NAD的相互作用。此外，NAD结合复合物的结构表明，R223提供与NAD的弱疏水相互作用，而在三重突变体中，发现R223与NCD胞嘧啶部分上的氧原子之间存在氢键相互作用（图S4）。

之后作者进行了第三轮ISM，获得了一个突变体FDH_A199C/E261P/S381N，具有比上述三重突变体略低的NCD偏好。并以其为模板，根据TSCM策略，最终得到了NCD偏好显著的突变体FDH_V198I/C256I/P260S/E261P/S381N（表1）。后以其模板，采用相同的方法突变，选择了在NAD腺嘌呤部分8.0Å 内发现的残基进行单位点饱和诱变，后续对其活性筛选得到具有最小的NAD最小活性，同时对NCD具有优异的选择性的六重突变体FDH_V198I/C256I/P260S/E261P/S381N/S383F。

动力学分析表明，该突变体的NCD偏好为170.5，与pseFDH相比增加了3700倍以上（表1）。S383位于C端loop环上主要影响了对辅因子的偏好。该突变体对NAD的K_m值为8.0 mM，高于正常细胞培养条件下约3倍。然而，这些突变体对NCD的催化效率与野生型pseFDH相似。K_m在0.1mM NCD的环境下测定其活性发现，突变体对NCD的K_m值约为0.1mM，远高于NAD的pseFDH的K_m值，其结果与高通量筛选方案一致。

为了进一步阐明NCD结合的分子基础，通过同源建模模拟了六重突变体的结构。发现六重突变体与三重突变体相比，P260S突变导致主要的二级结构变化，新形成的结构向内移动到辅因子结合袋中，使得其区域受限结构紧凑。Ile残基的侧链更靠近辅因子结合袋，表明与NCD的胞嘧啶部分有更多的疏水相互作用。在pseFDH–NAD复合物中，S381-H259-E261的氢键网络通过与NAD相互作用而稳定，而这种氢键网络不存在于三重突变体中。

为了更深入地了解辅因子偏好，作者预估了核苷酸结合隧道的尺寸。在pseFDH中，残基D222、R223、C256和H259形成了一个宽敞的口袋，C256和R223之间的距离为8.1Å（图2d）。在同源模型的三突变体和六突变体中，I256和R223之间的距离减小到7.1Å，而H259被推开，突变体的核苷酸结合通道变窄，这有利于较小尺寸的辅因子如NCD的进入，且突变体与NCD的分子相互作用更多（具体见附加材料）。

为检查这些突变是否对底物结合和催化产生不利影响，作者还测量了甲酸盐的动力学参数。发现辅因子为NAD时，这些pseFDH突变体的Km（formate）值非常接近。对于三重突变体和六重突变体，在NCD存在下对甲酸的催化效率类似于与NAD配对的pseFDH，与已知pseFDH遵循甲酸盐和NAD独立结合的随机双动力学机制一致。而在2.0 mM NAD的存在下，三重突变体和六重突变体催化活性较低，因其对NAD偏好较低，催化效率大幅下降，使表观Km（formate）值增加了7倍以上。总的来说，作者的结果与先前的观察一致，即当使用非天然辅因子时，工程氧化还原酶可以保持类似的底物亲和力。

为了证明用工程化的FDH突变体产生NCDH的适用性，作者通过将突变体与NCD优选的D-乳酸脱氢酶（DLDH）突变体DLDH_V152R组合，构建了耦合氧化还原系统。结果表明，当加入100 μm NCD时，5.0 mM甲酸盐在30分钟内耗尽，并形成等量的D-乳酸（如下图），表明此系统在减少功率转移和反应平衡偏移方面具有理想的化学计量比。

为了测试氧化还原系统的正交性，作者使用NAD作为辅因子，选取六重突变体和NAD依赖性的DLDH，但未消耗甲酸盐时即可检测到少量乳酸（图3B，实线）。而野生型pseFDH的对照实验表明，在NAD或NCD作为辅助因子存在下，甲酸盐被消耗并生成D-乳酸（如下图）。这些结果表明，此突变体在辅因子水平上可以创建与天然NAD依赖性系统正交的新型生物催化系统，具有与其他NCD依赖性酶偶联的巨大应用潜力。此外，当偶联酶催化能够固定甲酸盐的氧化产物CO2的反应时，如苹果酸酶、异柠檬酸脱氢酶或烯醇辅酶a羧化酶/还原酶，可以形成更多将甲酸盐用作电子源和碳源的生物催化系统。

总之，作者设计了偏好非天然辅因子NCD的pseFDH，阐明了辅因子偏好转换的结构特征，并证明了其对NCDH再生的作用。这些偏好NCD的FDH突变体具有压缩的核苷结合袋的能力，并产生新的分子水平上的相互作用。此外，这项工作为偏好非天然辅因子的其他NAD依赖性酶工程学改造提供了有价值的信息。作者希望这些FDH突变体能在合成生物学和生物催化化学等领域得到更广泛的应用。

整理：王鑫源

DOI: 10.1002/chem.2020031