今天推送的文章发表在Applied and Environmental Microbiology上的“Structural Analysis and Construction of a Thermostable Antifungal Chitinase”，作者为琉球大学的Kazuhiko Ishikawa。

据报道，近80%的植物病原体是真菌，它们对农作物的损害已成为农业领域中的一个重大问题。迄今为止，化学杀菌剂已被广泛用于防治当前的植物病害。然而，由于真菌是像哺乳动物一样的真核生物，因此许多化学杀真菌剂对人类和真菌具有剧毒，并且它们的使用与风险有关。因此，真菌特异性抗真菌剂的开发需求量很大。在病原攻击中，植物产生病原相关(PR)蛋白作为系统获得性抗性的一部分。植物几丁质酶被认为是这些PR蛋白之一。几丁质酶是一种将几丁质降解为寡聚体的酶，已被发现存在于多种生物体中。由于与真菌细胞相比，动物细胞中不存在几丁质，因此通过酶促水解真菌细胞壁表现出抗真菌活性的几丁质酶有望用作真菌特异性抗真菌剂。根据CAZy数据库(http://www.cazy.org/)，大多数几丁质酶(EC 3.2.1.14)可分为两个家族，糖苷水解酶(GH)家族18(GH18)和19(GH19)，基于其催化区域的氨基酸序列。此外，植物几丁质酶根据其结构域组织和环缺失至少分为五类（I、II、III、IV和V类）。

植物GH19几丁质酶具有抗真菌活性的报道很多；然而，关于植物GH18几丁质酶的抗真菌活性的报道很少。GlxChiB是一种基本的I类几丁质酶(32 kDa, pI 9.3)，具有最高的抗真菌活性。GlxChiB由两个结构域组成，碳水化合物结合模块家族18(CBM18)作为几丁质结合结构域(ChBD)和GH19结构域作为催化结构域。GlxChiB的最适温度为50–60 °C，但该酶在60 °C以上时不稳定。对于酶的工业用途，其高活性和热稳定性是重要因素。许多酶的热稳定性已通过蛋白质工程方法得到改善。随机突变是提高热稳定性的工具。最近计算设计可以应用于蛋白质设计。使用蛋白质模型或结构数据进行合理的蛋白质设计正在发展成为构建热稳定酶的强大而有效的工具。作者解决了WT和热稳定突变体GlxChiB的催化结构域的晶体结构，该突变体通过蛋白质工程方法理性设计，不影响水解和抗真菌活性。此外，基于WT和热稳定酶的晶体结构，讨论了每个突变的机制和对热稳定效应的新认识。

几丁质酶的结构特征和晶体结构

GlxChiB属于GH19家族，在N末端含有几丁质结合结构域(ChBD)，并表现出对几丁质降解和抗真菌活性的高催化活性。来自植物的GH19几丁质酶的多序列比对如图1所示。与用于多序列比对的其他几丁质酶相比，GlxChiB似乎具有很强的抗真菌活性，但这种酶在60 °C以上不稳定。含有四个二硫键的低分子量ChBD（氨基酸编号1-39）似乎是一种热稳定性蛋白质。WT和截短催化结构域的重组GlxChiB的最佳温度和pH特性相似。因此，只有WT GlxChiB的截短催化结构域（CD-WT；氨基酸编号45-289）是晶体结构测定的对象，以探索本研究中提高热稳定性的目标位点。制备和纯化酶的重组催化结构域，在20 °C下超过1周后获得大小约为200×200×200 μm的晶体。在KEK PF BL5A处以1.000 Å的波长收集衍射数据集。如表1所示。衍射数据的收集分辨率高达1.6 Å。晶体属于空间群P2₁2₁2₁的正交晶系，晶胞a=90.900 Å，b=106.583 Å，c=107.656 Å。结构的初始相是通过用CCP4包中的Phaser进行分子置换来确定的，使用几丁质酶形式Vigna unguiculata（PDB ID：4TX7）的晶体结构作为搜索模型。在不对称单元中，鉴定出四个CD-WT分子；Matthews系数(V_M)计算为2.32 ųDa^-1，溶剂含量为47%(vol/vol)。使用Refmac5进行细化后，模型的R因子估计为R_work22.7%和R_free25.3%。R_free的值是从包含所有反射的5%的测试集获得的。总体而言，CD-WT的结构由11个螺旋片段和连接这些螺旋的环和3个在其他GH19几丁质酶中非常保守的二硫键组成（图1和2）。模型的Ramachandran图显示98%的残基位于最有利的区域，2%的残基位于额外的允许区域。Trp165位于Ramachandran轮廓区域，具有明确的电子密度。Tyr140、Trp165和Tyr167之间的疏水相互作用可能导致Try165的肽键扭曲。四个GlxChiB分子的整体结构由45到288个残基构成（图2A，左），其中所有Cα原子的均方根偏差(RMSD)小于0.457 Å。RMSD值表明GlxChiB的四个分子的整体结构几乎相同。

GlxChiB耐热突变体的设计

几丁质酶之间的序列比对，来自Oryza sativa的I类几丁质酶（PDB ID：2DKV）、来自Vigna unguiculata的I类几丁质酶的催化结构域（PDB ID：4TX7）、来自Secale cereale(rye)的II类几丁质酶（PDB ID：4DWX）和来自Carica papaya的II类几丁质酶（PDB ID：3CQL），如图1所示。在几丁质酶序列的催化结构域中，催化残基、二硫键和整体结构都非常保守。脯氨酸是唯一具有仲胺的氨基酸，因为侧链直接与主链的氮相连，防止肽键的phi角旋转。因此，蛋白质中的脯氨酸残基使环区域的主链变硬，其中一些对稳定性至关重要，包括蛋白质的热稳定性。有人提出可以通过引入降低去折叠构型熵的脯氨酸来提高蛋白质的热稳定性。在GlxChiB序列的催化结构域中，一些其他几丁质酶中脯氨酸残基保守的残基被其他氨基酸取代（图1）。因此，在CD-WT中引入脯氨酸残基似乎是耐受的，并有助于提高其热稳定性。作者首先注意到用于构建热稳定突变体的脯氨酸残基。在这些酶中，脯氨酸残基在CD-WT中不保守的五个位置（Ala117、Ala151、Gln171、Ala233和Ala254）（图1和3）是突变的显着点。参照CD-WT的晶体结构，Ala117位于β-转角I的第二个位点（图4A），Ala151位于β-转角II的第二个位点（图4B），Gln171位于Ala233和Ala254位于螺旋结构的中间（图4C），而Ala233和Ala254位于保守螺旋结构之前的环区（图4D和E）。在CD-WT中使用了以下五个替代突变：A117P、A151P、Q171P、A233P和A254P。

连接两个半胱氨酸和它们各自的主肽链的二硫键可以限制未折叠的蛋白质无规卷曲的运动或稳定蛋白质的折叠状态。一个二硫键可以为蛋白质的热力学稳定性贡献2.3–5.2 kcal/mol。大量证据表明，设计二硫键在蛋白质中的热稳定性效应。晶体结构分析表明，CD-WT总共含有9个Cys残基，含有3个二硫键和3个游离Cys残基。使用程序SSBOND参考CD-WT的晶体结构，作者找不到可以在CD-WT中引入额外二硫键的合适位置。据估计，在所有CD-WT分子中，N端Asp45和Lys83的Cas之间的距离为6-8 Å，稍长一点形成二硫键。作者没有ChBD和CD-WT之间的接头区域（氨基酸编号40-44）的结构信息。然而，在Asp45和Lys83之前的Gly44（在接头区域中）Cas之间的距离可能比Asp和Lys83之间的距离更短，因为与结构域相比，接头区域被认为适应各种构象。因此，可以形成Cys44和Cys83之间的二硫键（图3）和G44C/K83C中使用的突变体。

盐桥在许多蛋白质的热稳定性中起重要作用。可电离的侧链经常在许多蛋白质结构中形成离子对。由于相反电荷之间的静电吸引力本身很强，盐桥可以被视为稳定蛋白质结构的重要因素。此外，在嗜热酶表面观察到许多盐桥。环区250-255位于GlxChiB中两个螺旋之间的表面环区（图3和图5）。在该环区，在GlxChiB的Gln250、Lys253和Gln255之间未观察到盐桥，而在2DKV、4TX7和4DWX的相应区域观察到显着的盐桥。因此，loop区域可能是GlxChiB的柔性弱点。作者尝试通过参考这些结构和多序列比对来修饰这三个氨基酸Q250/K253/Q255以在该区域引入盐桥（图1、3和5）。制备了两个突变体，Q250K/K253D/Q255R和Q250R/K253D/Q255R。

突变体热稳定性的比较

制备和纯化上述重组GlxChiB及其突变体，进行酶活性测定。它们在37 °C时的特定活动不受这些突变的显着影响（表2）。WTGlxChiB在pH 7.0 15分钟的条件下，在55 °C左右的温度下表现出最大活性。通过在60 °C温育后酶的残留活性检查热稳定性。所有脯氨酸取代突变体都显示出比WT更长的半衰期（表2）。此外，对于通过差示扫描量热法（DSC）测量的突变体的熔解温度（T_m），所有脯氨酸取代突变体都表现出比WT更高的T_m值（表2）。对于G44C/K83C，T_m没有显着变化；然而，它在60 °C时的半衰期延长了（表2）。通常，DSC获得的T_m值和半衰期都被用作热稳定性的指标。然而，半衰期的评估表明在这种情况下严格地酶的不可逆变性。对于引入盐桥网络的两个突变体（Q250K/K253D/Q255R和Q250R/K253D/Q255R），在37 °C下的比活性略有增加，在60 °C下的半衰期延长（表2）。

整合的脯氨酸突变体及其晶体结构

对于热稳定脯氨酸替代突变体（A117P、A151P、Q171P、A233P和A254P），没有观察到酶活性或抗真菌活性降低（表2和图6）。表2表明，这些替换不影响这两种活性。所有脯氨酸替代物在60 °C下的半衰期比WT长1.4-2.4倍，并且个体对热稳定性的影响被认为是累积的。为了检查脯氨酸取代对酶热稳定性的结构影响，作者制备了整合突变体mt5(A117P/A151P/Q171P/A233P/A254P)并解析了mt5(CD-mt5)催化结构域的晶体结构。CD-mt5的制备和纯化与CD-WT相同。CD-mt5的晶体在与CD-WT不同的条件下生长。数据收集和细化统计如表1所示。衍射数据以1.80 Å的分辨率收集。晶体属于C2空间群，晶胞a=140.58 Å，b=38.89 Å，c=177.74 Å，b=96.03°；该晶体系统与CD-WT的晶体系统完全不同。不对称单元中四个分子的整体结构从45到288构建（图2A，右），其中Cα原子的RMSD小于0.455 Å。RMSD值表明CD-mt5的四个分子的整体结构几乎相同。此外，链A中CD-WT和CD-mt5之间Cα原子的RMSD平均小于0.530 Å。这一结果表明，WT和mt5之间的整体结构和活性位点几乎相同。图2B和图4显示了CD-WT和CD-mt5在五个突变位点（A117P、A151P、Q171P、A233P和A254P）和活性位点残基Glu111和Glu133的结构差异。突变点周围的主链和侧链结构不受这些突变的影响。该结果表明，将脯氨酸残基引入WT的所有位置对于构建热稳定酶都是理想的。

通过晶体结构分析证明，将G44C/K83C和Q250K/K253D/Q255R额外突变为mt5也是构建热稳定酶的理想选择。因此，对所有阳性突变（mt5、G44C/K83C、Q250K/K253D/Q255R）进行整合和检查。表2显示这些突变不影响比活性，并且由突变引起的热稳定性的个体效应是相加的。60 °C下的半衰期因累积突变而延长：mt5、mt5/G44C/K83C(mt5ss)和mt5ss/Q250K/K253D/Q255R在60 °C下的半衰期分别比WT长约7、11和15倍（表2和图7A）。mt5ss/Q250K/K253D/Q255R被证明是本研究的最佳酶（表2）。然而，对于第250位，在其他GH19几丁质酶（2DKV和4DWX）中观察到组氨酸残基（图1）。此外，还检查了替代突变体mt5ss/Q250H/K253D/Q255R（表2）。mt5ss/Q250H/K253D/Q255R和mt5ss/Q250K/K254D/Q255R在60 ℃半衰期无显着差异，但mt5ss/Q250H/K253D/Q255R在65 ℃半衰期约为两倍长于mt5ss/Q250K/K254D/Q255R（表2和图7B）。mt5ss/Q250H/K253D/Q255R在突变体中Tm最高（71.1 °C：比WT高6.9 °C），在60 °C下半衰期延长15倍，在65 °C下延长90倍（表2）。

突变体抗真菌活性的比较

GlxChiB及其突变体的抗真菌活性通过使用绿色木霉作为测试真菌的菌丝再延伸抑制测定来确定（图6）。作者将IC₅₀定义为抑制50%的菌丝再延伸区域的浓度。如表2和图6所示，WT的IC₅₀为1.56±0.562 μM，所有突变体的抗真菌活性均表现出与WT相同的水平。表明所有热稳定性突变对其抗真菌活性均无显著影响。

整理：孙骁

文章信息：

DOI：10.1128/aem.00652-22

文章链接：https://doi.org/10.1128/aem.00652-22