单分子生物物理 single molecule biophysics

ATP分子

物理学与分子生物学的交叉学科。运用单分子操纵与实时视见技术研究单个生物大分子〔蛋白质、脱氧核糖核酸（DNA）与核糖核酸（RNA）等〕的运动轨迹，或它们相互作用的时间过程以及动力学，从而使生命活动过程认识达到分子水平。

1.历史背景

20世纪90年代以前，对细胞内生物大分子的物理、化学性质的研究，都是根据集群测量得出的，这只是反映大量分子的平均行为。近年来，这种“试管生物物理”有了革命性的发展，由20世纪80年代物理学家发明的单分子操纵技术，如由扫描扫隧道显微镜（STM）开发出来的原子力显微镜（AFM）、光镊、流场拖曳、磁钳，可对单个生物大分子施以力或力矩，并测量它们的物理性质（如DNA弹性、蛋白质的力学变性等）及力学生化反应（如分子马达）。

细胞骨架的一部分

分子马达是能够利用化学能来做功的生物大分子的统称，它们包括肌球蛋白、驱动蛋白、RNA聚合酶和拓扑异构酶等。1993～1994年，三个小组美国S.布洛克、美国J.斯普迪赫和日本柳田敏雄首次测量肌球与驱动蛋白的单分子马达力信号。1997年，日本木下一彦领导的小组看到了单个ATP酶分子中的γ-亚单元在“生物燃料分子”腺苷三磷酸（ATP）供应下的“步进电机”式转动，即360°是由三次120°完成，而120°转动是由90°加30°两个档级进行的。

DNA分子

这些单分子实验克服以往“试管试验”的静态不整与动态不整两个根本性弱点，给出分子实时行为与性质的分布，避免了对集群测量苛刻的同步要求。利用单分子技术研究酶的催化反应已可把底物结合、水解、或其他催化步骤区分开来。酶促变量（如催化速率等）作为时间的分布函数的积分同时也给出了集群的性质。虽然大多数集群性质可由其单分子数据平均得到，但反之则不能成立，如DNA的解链、蛋白质的折叠是不可能由集群性质得到的。

除了单分子操纵，单分子实时视见也是近几年单分子生物学的发展热点。细胞活体研究中，荧光蛋自（GFP和DsRed）的发现开辟了光单分子检测的新领域，并涉及物理光学的最新技术，如近场扫描光学显微镜和广野显微镜等。

2.皮牛顿力学

生物大分子（如分子马达）运动或转动主要靠ATP水解获得能量。一个ATP分子水解能约20kT，这里k是玻耳兹曼常数，T是温度。焦，分子马达移动尺度约10纳米，因此一个ATP驱动的力约为5皮牛。

原子力显微镜

DNA解链实验中，需要打开互补碱基对的氢键。蛋白质变性（去折叠）实验涉及氨基酸残基间“非共价”的键，以及疏水作用，它们所需的力约在100皮牛范围。蛋白质分解、DNA和RNA酶切涉及断开共价键，所需的力是最强的单分子力，约1000皮牛。

但这对于无生命的固态物理实验，只相当于在0.1纳米品格做1电子伏功所需的力。因此，单分子生物物理所需的力是非常微弱的力，其检测实现要晚于固态物理是可想见的。

3.单分子操纵与视见技术

对DNA、RNA拉伸时，这些生物高分子的一端是固定在固体表面，另一端连接在一种力敏感单元，它们可由AFM或光镊直接施力操纵，测量其位移便可确定生物大分子所受的力。

AFM的悬臂可测量到毫秒间0.1纳米的位移及大于10皮牛的力。一般的AFM玻璃微丝在体积上大于悬臂，因此时空分辨率不如后者，但测力精度可达到皮牛或0.1皮牛级。

光镊可测到亚秒时间内的皮牛力与纳米的位移。由巴黎高师统计物理实验室发明的磁镊技术的力敏单元是一种磁性颗粒，垂直移动磁场或旋转磁场可同时对生物大分子施力或力矩。

单分子实时视见，主要依据入射光激发的生物分子内源荧光团或发光团受激斯托克斯发射。技术关键在于被激活的容积要小（如纳升或飞升），这才能保证激活容积中只有一个分子与激光其振。对于无内源光团的生物分子，可加一个荧光基团，如绿色荧光蛋白（GFP）到待测分子上去，即所谓的荧光蛋白探针。GFP探针与荧光显微镜技术已经带来活细胞单分子实时视见的革命，如2001年美国《科学》周刊报道了单个病毒粒进入细胞膜及核的全过程。

4.复杂的熵弹性

对双链DNA（dsDNA）、单链DNA（ssDNA）以及RNA二级结构的单分子力学实验的理论解释已带来高分子物理的一场革命。

生物高分子不同于传统高分子，表现在序列的非均匀性、序列之间相互作用的特异性，以及序列高级结构引起的序列之间的“远程作用”。这里的“远程”不是空间意义上的远距离作用，而是由于高分子链随机弯曲而使延链相隔甚远的序列在空间上变成近邻的相互作用。这种复杂相互作用，给生物大分子的单分子力学（无论是平衡还是远离平衡）带来了一些基本的统计物理新问题。

一条高分子链的自由能（F=U-TS）是由内能U与熵能（-TS）组成的，这里T是温度，S=klnω是构形熵，ω是构形数。如果单分子力还不能引起共价键的破坏，则影响的仅是熵能的改变。如果链的首尾端距很小，这时的链有无数的构形（S大，自由能低）。如果首尾端距增大，则构形数必定减少（在极端的直链情况构形只有一种），即自由能升高。

用单分子力拉伸生物高分子的过程会像拉弹簧一样增加链的自由能，故-TS也叫熵弹性能。由于生物大分子序列的复杂性，这种熵弹性已不能用传统的高分子理论进行描述。如dsDNA单分子拉伸实验曲线在70皮牛左右出现一个上述理论无法解释的阶跃伸长平台，伸长量达到1.7倍DNA B-形式的长度，被称为超伸展的S-形式。DNA的B-形式即沃森与克里克发现的DNA双螺旋标准形式。

中国学者1999年把DNA碱基对相互作用引入dsDNA的弹性问题，很好地解释了B-S结构相变。对更复杂的ssDNA与RNA的拉伸实验的理论解释仍然是理论生物物理挑战的难题。

5.DNA与白质的单分子相互作用

用单分子拉伸DNA可观察到DNA与蛋白质相互作用的事件。如由于加入酶蛋白于所拉伸的DNA溶液，则随着酶浓度增加，DNA的力-伸长与力矩-伸长曲线会呈现不同的结构相变平台。若加入的是拓扑异构酶，它与DNA的作用就是改变DNA的超螺旋度即改变其拧数或扭曲数（如拓扑酶Ⅱ可使DNA松开两圈），因此作用发生时会实时记录几十纳米的跃变伸长。

类似的现象还发生在DNA与解螺旋酶、RNA聚合酶、转录因子、核酸外切酶的相互作用。这些酶在DNA复制、转录时起作用，解开或拧松DNA双螺旋，引起力-伸长曲线出现实时变化。反过来，用力与力矩可改变DNA的构形、改变其与ATP及上述各种酶的结合能力，因此单分子操纵已成为一种调控酶的活性的新参数。这些用单分子技术直接研究生物大分子之间的相互作用是2000年分子生物学最大的进展。

摘自：《中国大百科全书（第2版）》第4册，中国大百科全书出版社，2009年