今天推送的文章发表在ACS Catalysis的“A P450 Harboring Manganese Protoporphyrin IX Generates a Manganese Analogue of Compound I by Activating Dioxygen”，通讯作者为名古屋大学研究生院化学系的Osami Shoji。

P450作为合成化学领域有前景的生物催化剂而受到越来越多的关注，因为它们可以催化大量具有挑战性的氧化反应，包括区域选择性和立体选择性激活一系列非活性C-H键在P450氧化反应中，由天然铁卟啉辅因子（血红素）生成的活性物质Fe(IV)-氧代卟啉阳离子自由基通常称为“化合物I”。由于化合物I的反应性高度依赖于辅因子的物理化学性质，在许多研究中已将血红素与合成卟啉进行交换，以调节P450的性质。将几种合成金属络合物，例如铱、锰、钴、钼、锌、和铝卟啉，引入P450s的血红素结合位点，特别是铱卟啉被证明赋予P450s非天然活性。然而，这种方法通常伴随着P450s原始氧化功能的丧失，仅有少数关于替代P450中的血红素保留天然氧化反应的报道，且没有一个表现出与野生型酶同等的活性。只有有限数量的含锰人造金属蛋白对C-H活化反应具有活性。光谱分析揭示了在Mn-PPIX重组的P450cam和HRP中，添加氧化剂后形成了Mn(IV)-氧代卟啉物。已知这种 Mn(IV)-氧代卟啉物对C-H活化反应的活性显着降低，可以解释为什么锰取代的 P450 对 C-H 活化的活性降低。

与大多数报道的锰取代血红蛋白不同，作者在之前的研究中显示含有Mn-PPIX (Mn-BM3) 的全长P450BM3保留其对氧化C-H的活性，表明Mn-BM3可以激活分子氧。尽管之前的结果表明形成了以锰为中心的活性物质，但其详细的反应性尚未得到充分研究。在这项研究中，作者测试了Mn-BM3的反应范围，并结合自由基时钟实验和DFT研究获得了对其活性氧物的机理见解。

Mn-BM3的制备及其催化活性

作者开发了一种方法来制备包含非天然辅因子的全长P450BM3，使用转肽酶分选酶A将重组的血红素结构域与其还原酶结构域融合（图1）。如果与P450BM3的还原酶结构域融合，Mn-PPIX可能表现O₂活化活性。用Mn-PPIX重构的BM3血红素结构域的光谱与其他报道的光谱相同，意味着Mn-PPIX在活性位点与半胱氨酸连接。且Mn-BM3在O₂存在时显示单加氧酶活性，在O₂不存在时没有活性；也就是说，Mn-BM3需要O₂才能进行催化。

为了进一步支持溶解氧在催化过程中的作用，以环己烷为底物进行了¹⁸O标记实验（图 2）。GC-MS分析表明¹⁸O被掺入羟基化产物（环己醇）中，证明Mn-BM3以与天然P450相同的方式催化O₂活化/羟基化反应，且还原酶结构域作为电子介质以与天然含血红素的P450BM3相同的方式激活O₂。Mn-PPIX结合BM3血红素域 (Mn-BM3h)的还原电位也支持域间电子转移的可能性。Mn-BM3h的还原电位相对于标准氢电极为-302 mV，足够允许电子从FMN域转移（表1）。

为了测试Mn-BM3的活性物质的反应范围，作者制备了I401P突变体，据报道它对各种非天然底物表现出更高的反应性。结果发现Mn-BM3的I401P突变体对天然底物类似物10-pNCA 的催化效率高于野生型Mn-BM3，因此I401P突变体适合后续研究。对I401P突变体的晶体学分析表明，活性位点结构与野生型Mn-BM3的报告结构相同（图3）。

为了进一步提高对各种非天然底物的反应性，作者采用了先前报道的底物类似物（诱饵分子）。据报道，诱饵分子可激活P450BM3氧化非天然底物，例如乙烷、苯、环己烷和苯乙烯，并调节前手性底物的立体选择性。在诱饵分子存在的情况下，Mn-BM3 I401P对多种底物表现出活性，能够催化硫代苯甲醚的磺化氧化、苯乙烯的环氧化以及脂肪族、芳香族和苄基 C-H键的羟基化（图4）。Mn-BM3 I401P还能够催化乙烷的羟基化，这一反应因高C-H键解离能而具有挑战性。这意味着Mn-BM3 I401P的活性物至少与天然P450BM3 (Fe-BM3)的化合物I一样具有活性。

自由基时钟实验

为了获得有关活性氧物的更多信息，作者使用自由基时钟1-甲基-2-苯基环丙烷1和去甲卡拉烷2进行了实验。当化合物I从1的甲基中提取一个氢原子时，环丙基甲基自由基 [1a•] 经历快速自由基重排，形成重排中间体 [1b•]（方案 1）。由于Fe-化合物I的OH重组过程与自由基重排一样快，因此得到了未重排的1a和重排的1b产物。根据未重排/重排产物 [U]/[R] 的比率，可以估计C-O键的形成率（rebound ratek_rebound）和底物自由基的平均寿命（自由基寿命 τ）。

作者进行了全长Mn-BM3 I401P与自由基时钟1的反应，并观察到产物1a和1b；然而，1b 与1a的比率高于野生型Fe-BM3及其I401P突变体。重排产物1b形成的增加证明了Mn-BM3 I401P的活性物以与包含Fe-BM3的含血红素的P450相同的“H原子提取/•OH重组”方式进行羟基化反应。Fe-BM3 I401P的平均自由基寿命要比Mn-BM3 I401P短得多（表2）。

在合成锰卟啉催化的氧化反应中，通常观察到相对缓慢的rebound过程，这归因于Mn(V)-氧代卟啉物。先前的研究对•OH与Mn(IV)-OH和Fe(IV)-OH的转移反应进行了比较研究，证明•OH转移率因中心金属（铁和锰）而异。本研究的实验结果表明，仅通过将中心金属从铁更改为锰即可显着改变rebound反应速率。作为Mn-卟啉的活性物，已知在添加过氧化物时会生成Mn(V)-和 Mn(IV)-oxo。众所周知，许多Mn(V)-ox能够通过“H原子提取/•OH重组”对C-H键进行羟基化。相比之下，据报道Mn(IV)-氧代卟啉物与 Mn(V)-氧代物不同，可能通过非rebound途径进行氧化反应。反应机理的这一特性支持了Mn(V)-oxo参与了Mn-BM3的反应。基于获得的结果和先前报道的Mn-oxo物的反应性，作者描述了由Mn-BM3 I401P催化的羟基化反应的合理机制（方案2）。

随后进行了与去甲卡拉烷2的反应（方案3，表3），观察到未重排产物2a和自由基重排产物2b，而没有观察到离子C-H裂解后通过阳离子中间体形成的七元环产物。从2a和2b的比率来看，Mn-BM3的自由基的平均寿命也明显高于野生型Fe-BM3。

此外，观察到的Mn-BM3 I401P的rebound率快于报道的Mn-卟啉。与报道的合成锰卟啉相比，这种更快的rebound速率可能是由于P450BM3的狭窄反应空间阻碍了自由基笼的逃逸，因此加快了rebound速率。这一假设与之前的研究一致，表明P450s的rebound过程受底物结合方向的影响。诱饵分子调节P450s中活性位点腔的形状和大小，从而影响自由基时钟底物的结合模式。基于这些结果，作者引入了F87A突变（图5），它增加了活性位点腔的大小。预计这会导致 2结合不那么紧密，从而导致rebound速率下降。如预期那样，Mn-BM3 I401P的F87A突变体的自由基寿命增加了三倍（表3）。此外，该实验表明，可以通过修改活性位点腔来控制自由基寿命。由于rebound速率的微调对于开发杂原子rebound速率反应（例如卤化反应）的催化剂具有重要意义，这些发现将有利于发展人工P450催化杂原子rebound反应。

计算研究

尽管对锰卟啉的反应性进行了大量的计算研究，但对硫醇盐连接的锰卟啉的计算研究却很少。基于激进时钟实验提出的“H 原子抽象/OH 重组”机制，作者对Mn-BM3进行了密度泛函理论 (DFT)计算（图6）。该计算研究在巯基甲基连接的Fe/Mn-卟啉系统上进行，该系统近似于实际半胱氨酸连接的铁/锰-原卟啉IX系统。先前对Mn(V)(OH)oxo porphyrin系统的研究报告了闭壳单重态基态，而作者对Mn(V)(SCH3)oxo卟啉系统的计算研究表明了五重基态，这可能是由于硫醇盐配体的给电子性质。

在rebound步骤中，Fe(IV)-羟基卟啉物质在其二重态显示出几乎无屏障的通路，在其四重态显示出小的反应能垒，这被称为“双态反应性”，这归因于其超快的rebound过程。相比之下，Mn(IV)-羟基卟啉需要更高的活化能（五重态为5.4 kcal mol^-1，三重态为13.1 kcal mol^-1），这与在自由基时钟实验中观察到的缓慢自由基rebound一致。

DFT研究还表明，在H原子提取步骤中存在潜在的系统间交叉途径，对于Mn(V)-oxo的三重态，计算的活化能垒为ΔΔG = 18.3 kcal mol^-1，比四重态低10.2 kcal mol^-1。因此，预计H原子提取步骤将发生在三重态。然而，这种三重态的rebound能垒比五重态高7.7 kcal mol^-1，这表明硫醇盐连接的Mn-卟啉可能通过系统间交叉发生三重态/五重态转变以最小化活化能垒。尽管如此，Mn-oxo在rebound步骤中经历了更高的活化能，因此这项计算研究与在自由基时钟实验中获得的结果一致。