简介

胰蛋白酶消化后，用EDTA分散从皮肤片分离的表皮片，然后用添加bFGF（FGF-2）的无血清培养液培养。

操作方法

黑素细胞的培养

原理

胰蛋白酶消化后，用EDTA分散从皮肤片分离的表皮片，然后用添加bFGF（FGF-2）的无血清培养液培养。

材料与仪器

D-PBSA胎牛血清大豆胰蛋白酶抑制剂
添加激素的黑素细胞培养液胰蛋白酶和EDTA混合液
组织培养皿吸管离心管湿润的培养箱水浴箱电子细胞计数仪或血细胞计数板

步骤

原代培养
第1天
1.用70%乙醇浸洗皮肤标本，然后用D-PBSA浸洗2次。
2.将组织移入无菌100 mm培养皿，表皮面朝下。
3.用解剖剪除去皮下脂肪和深部真皮。
4.将剩余的组织用手术刀切成2 mm×2 mm小块。刀片在组织上摇动，但不要采用锯切。
5.将组织块移入盛有冷的0.25%胰蛋内酶的15ml离心管。
6.在室温条件下，将组织块孵育60~90 min。对于某些供体的皮肤，先在4°C条件下孵育18~24 h，然后在37°C条件下孵育1~2 h，这样可获得较多的黑素细胞。
第2天
7.轻拍离心管，使沉于底部的组织块移动。然后，将离心管内的内容物快速倒入60 mm培养皿。
8.用手术镊将组织块逐一地移入100 mm干培养皿，上皮面朝下。轻轻摇动组织块，使其接触培养皿底壁。应使表皮层附着在培养皿上，以便用手术镊彻底分离真皮。除去真皮片。
9.将表皮片移入盛有5 ml 0.02%EDTA（0.7 mmol/L）的15 ml离心管。注意将表皮片放入EDTA液，不要贴在离心管壁上。
10.轻轻摇晃离心管，使表皮片分散成单细胞。
11.离心（350 g，5 min），然后吸去上清液。
12.用MHSM混悬细胞。
13.用血细胞计数板计数细胞，然后在35 mm培养皿用2 ml含有5%FBS的MHSM孵育细胞，细胞密度为1×106个（约2×104~4×104个黑素细胞）。FBS促进细胞贴壁。
14.用含有生长因子和牛垂体提取物的MHSM换液，每周2次。
第3~30天
15.培养24 h后，培养的细胞中含有原代角质形成细胞和散在的黑素细胞。角质形成细胞在几天后停止增殖，角质形成细胞克隆在第2周浮起。第2周末，只剩有黑素细胞。在大多数情况下，细胞在2~4周内生长接近汇合，此时准备传代。

传代培养
16.用0.02%EDTA（0.7 mmol/L）轻轻浸洗细胞2次。
17.加入3 ml 0.25%胰蛋白酶和0.1%EDTA（2.5 mmol/L）混合液，在37°C条件下孵育。每5 min在相差显微镜下观察1次，检査细胞的去附着情况。
18.当大多数细胞去附着时，用10μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂或1 ml含有小牛血清的培养液使胰蛋白酶失活。传代时，“血淸刺激”有益于在无血清条件下维持黑索细胞生长。
19.吹打培养皿中的细胞，保证全部黑素细胞去附着。
20.吸出细胞悬液，离心（350 g，5 min)。
21.吸去上淸液，用含有5%FBS的无钙黑索细胞培养液混悬细胞。每个100 mm培养皿内放入2×104~4×104个细胞。黑素细胞很好地贴于塑料培养皿（>75%)要FBS。但是，如果培养皿涂有纤连蛋白或Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白混合物，可不用FBS[Gilchres te al.，1985]。
22.用无血清或含有血淸的黑素细胞培养液换液，每周2次。用含有血清的培养液培养能获得较多的细胞，但含有血淸的培养液促进成纤维细胞的生长。将Ca2＋浓度降至0.03 mmd/L不影响黑素细胞的增殖，但抑制成纤维细胞的过度生长[Naeyaert et al.，1991]。
添加激素的黑素细胞培养液（melanocyte hormone-supplemented medium，MHSM）：
(a)199培养液（400-1200，GIBCO）：93.1 ml；
(b)EGF（B-D Biosciences）：0.1 ml，储存浓度为10μg/ml，最终浓度为10 ng/ml；
(c)转铁蛋白（Sigma）：0.1 ml，储存浓度为10 mg/ml，最终浓度为10μg/ml；
(d)胰岛素（Sigma）：0.1 ml，储存浓度为10 mg/ml，最终浓度为10μg/ml；
(e)三碘甲状腺原氨酸（Sigma）：0.1 ml，储存浓度为1μmol/L，最终浓度为1 nmol/L；
(f)氧化可的松（Calbiochem）：0.5 ml，储存浓度为0.28 mmol/L，最终浓度为1.4μmol/L；
(g)霍乱毒素（Calbiochem）：1.0 ml，储存浓度为1μmol/L，最终浓度为1 nmol/L。可用牛垂体提取物和双丁酸环腺背酸代替霍乱毒素。牛垂体提取物（Clcmetics）的储存浓度为35μg/ml，最终浓度为0.7 ng/ml。双丁酸环腺汗酸（Sigma）的储存浓度为1 mmol/L，最终浓度为100μmol/L；
(h)bFGF（Amgen）：5.0 ml，储存浓度为200 ng/ml，最终浓度为10 ng/ml。