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An effective computational‐screening strategy for simultaneously improving both catalytic activity and thermostability of α‐L‐rhamnosidase

”通讯作者为集美大学食品与生物工程学院的倪辉教授。

催化效率和热稳定性是酶最重要的两个特性。然而，总是很难同时提高酶的催化效率和热稳定性。在该研究中，提出了一种采用双筛选步骤的计算策略，以同时提高酶的催化效率和热稳定性；并使用真菌α-L-鼠李糖苷酶来验证该策略。结果表明，通过对结合袋内的分子对接和序列比对分析，预测出7个候选突变体具有较好的催化效率。通过能量变异分析，预测了7个候选突变体中的A355N、S356Y和D525N具有较好的热稳定性。表达和鉴定结果表明，突变体D525N在酶活性和热稳定性方面均有显著改善。分子动力学模拟结果表明，这些突变位于催化结构域的5Å范围内，可以改善均方根偏差、静电、范德力相互作用和极性值，并在底物和酶之间形成水桥。研究表明，基于结合能、守恒程度和突变能分析的计算策略能够有效地开发具有更好的催化作用和热稳定性的酶，为开发工业酶提供了实用的途径。

筛选具有较好的催化效率和热稳定性的候选突变体

α-L-鼠李糖苷酶是一种糖苷水解酶，其序列同源性仅为20%-30%，但具有相似的（α/α）6桶催化结构域和几个β-夹层。到目前为止，已经确定了GH78家族的6个晶体结构（PDB：2OKX、3W5M、3CIH、4XHC、6GSZ和6I60）通过以α-L-鼠李糖苷酶2OKX、3W5M和4XHC为模板的晶体结构进行同源建模，构建了r-Rha1的结构并用于作者的研究。为了了解α-L-鼠李糖苷酶的非活性位点残基对催化效率的贡献，作者进行了生物信息学分析。具体来说，r-Rha1与其底物对硝基苯-α-L-鼠李糖喃苷（pNPR）进行对接，它们之间的相互作用可以为定点突变提供指导。例如，Lu等人报道了从蛋白质对接中鉴定出的一些氨基酸在催化作用中发挥了关键作用。Bernardi等人报道称，涉及催化结构域周围氨基酸的氢键对酶与其底物之间的接触贡献最大，可以通过突变来调节酶的活性。在r-Rha1与底物pNPR的结合模式下（图1a），r-Rha1的9个残基（Trp253、Tyr293、Thr301、Val302、Ser303、Ala355、Ser356、Asp525和Trp640）位于pNPR附近（图1b）。值得注意的是，其中一些残基可能对酶活性有重要意义，而不应该发生突变。根据Fujimoto等人结合的L-鼠李糖的结构，它夹在两个芳香族残基Trp640和Trp747之间，r-Rha1、Trp253和Trp640中相应的残基是这些必需的残基，在定点突变中不应被修饰。对不同来源的α-l-鼠李糖苷酶的氨基酸序列比对显示，r-Rha1与其他α-l-鼠李糖苷酶的相似性较低（图S1），但催化结构域的残基保守良好（表1）。r-Rha1模型显示，Tyr293和Trp253的侧链位于底物结合环附近，这对底物的结合起着重要作用。预测催化网站，Tyr293和Trp253的芳香环平行的鼠李糖和可能发挥角色在固定的底物通过pi-pi堆叠作用，这是符合Xu et al.报道，也就是说，疏水残基位于催化口袋。因此，应排除Trp253、Tyr293和Trp640进行诱变。因此，作者选择从分子对接中鉴定出的其余残基Thr301、Val302、Ser303、Ala355、Ser356和Asp525进行突变，以检测其对其催化活性的影响。其中，根据序列比对结果，设计了T301S、T301Q、T301G、V301G、V302S、V302A、V302A、V302N、S302N、S303V、S303G、A355N、A355G、S356I、S356Y、D525Y、D525N和D525G突变（表1）。

为了筛选出具有高热稳定性的突变体，采用Discovery studio 2019在60、65、70、70、75和80°C下评估了14个突变体的热稳定性，计算结果如图1c所示。结果表明，有7个突变体在60、65、70、75和80°C时保持稳定。它们分别是D525N、S356Y、D525G、S356I、A355N、S303V、V302N，序列稳定性从高到低。而突变体T301Q、T302S、T301S、V302A、S303G、A355G和T301G在不同温度下可能不稳定，这意味着7个突变体的热稳定性较低。因此，作者通过两轮筛选获得了7个突变体D525N、S356Y、D525G、S356I、A355N、S303V和V302N，这些突变体可能具有较高的酶活性和良好的热稳定性，可以通过实验验证。

具有更好的催化效率和热稳定性的候选突变体的表达和表征

通过定点突变获得了7种突变酶，并在毕赤酵母中进一步表达。与野生型（重组Rha1，命名为r-Rha1）相似，纯化的突变体酶的分子量约为100kDa（图S2）。图2a显示了突变体相对于野生型r-Rha1的相对水解活性。突变体V302N、S303V、S356I、D525G的水解活性均低于r-Rha1。相反，A355N、S356Y和D525N的水解活性分别比r-Rha1显著提高了45%、80%和180%。为了进一步研究A355N、S356Y和D525N对酶催化机制的影响，作者评价了A355N、S356Y和D525N对pNPR的动力学行为。如表2所示，A355N、S356Y和D525N的Km和kcat值均低于r-Rha1，而三个突变体的kcat/Km值均有所增加。突变体D525N的水解活性和催化效率在与野生型r-Rha1中均最高。与野生型r-Rha1相比，D525N的水解活性增加了2.85倍，kcat/Km值增加了1.54倍。

为了更深入地了解A355N、S356Y和D525N对酶特性的诱变作用，作者研究了其最适温度和热稳定性。与野生型r-Rha1相似，3个突变体的最适温度均为60°C（图2a）。突变体A355N和S356Y的热稳定性明显弱于r-Rha1（图2c），而突变体D525N的热稳定性略强于r-Rha1。当r-Rha1及其突变体在60°C、65°C和70°C下的热稳定性测试时，D525N的半衰期分别比r-Rha1长42 min、2 min和1 min（T_1/2）（图2b-d）。因此，D525N既具有提高的热稳定性，又提高了酶活性，这表明该筛选方法有助于识别具有提高酶活性和良好热稳定性的突变体。

一般人们对感兴趣的酶只关注的活性和热稳定性，还应该关注其它方面，这些突变是否改变了最佳的pH和水解效率。在pH 3.0-8.0下研究了A355N、S356Y和D525N的最适pH，结果表明，突变体的最适pH与r-Rha1相一致（图S3）。此外，还测定了突变体A355N、S356Y和D525N在天然底物上的水解效率（表S2）。可以发现，突变体A355N、S356Y和D525N对天然底物的水解效率与pNPR相似。这一结果表明，所设计的酶对广泛的人工和天然底物具有较高的催化活性，表明了新策略在提高催化能力方面的有效性。

具有较好的催化效率和热稳定性的突变体的二级结构特征

为了进一步探讨酶活性提高的突变体A355N、S356Y和D525N对热稳定性有两种不同特征的原因，作者利用远紫外CD研究了位点定向突变对其蛋白结构的影响。结果表明，WT和突变体的CD光谱几乎是100%的叠加（表S3）。如图S5所示，r-Rha1和三个突变体在205-245nm处均出现负峰，这是α-螺旋的典型特征，在185-195nm处的强正峰是β-折叠的典型特征。根据CD光谱计算了r-Rha1和突变体A355N、S356Y和D525N的二级结构。三种突变体的α-螺旋和β-转折略有下降，而β-折叠和随机突变略有增加。其中WT、A355N、S356Y和D525N的α-螺旋含量分别为27.5%、25.3%、25.3%和25.7%，β-折叠的含量分别为26.6%、27.6%、29.7%和28.6%。同时，突变体A355N、S356Y和D525N中的β-转折组分分别下降了0.7%、0.4%和0.6%。在图S5中，突变体A355N的Tm值与野生型相比几乎没有变化：S356Y的Tm是野生型的0.73倍，而D525N是1.1倍。这与Mohd et al.的报道一致，即一个或几个氨基酸的取代，导致突变体的热稳定性和最适温度的提高，但没有引起酶的二级结构的实质性变化。这意味着单个氨基酸的变化并没有引起二级结构的重大变化，而这三种突变体之间的热稳定性的差异不能归因于二级结构的变化。

催化效率和热稳定性较高的突变体的内部结构和分子相互作用的计算分析

MD和构象稳定性分析

基于上述对A355N、S356Y和D525N的实验分析，对这三个突变体进行了MD模拟，分析了其结构变化。RMSD是验证MD仿真质量的基本参数。在该研究中，野生型r-Rha1及其突变体的稳定性由MD模拟过程中产生的偏差决定的。如图S5所示，r-Rha1达到平衡后4 ns的MD模拟，RMSD值为0.5Å，而A355N达到平衡后11ns，RMSD值约为0.8Å，和S356Y和D525N达到平衡后5ns，RMSD值约为0.7Å。RMSD用于测量蛋白质骨架从初始结构构象到最终位置之间的差异（Bernardi et al.）。3个突变体的RMSD值均高于r-Rha1，表明突变体A355、S356Y和D525N可能影响酶的主干稳定性。之前在几个系统中也报道了类似的观察结果，包括糖苷水解酶和其他酶。

结合自由能分析

为了进一步了解点突变对α-l-鼠李糖苷酶与其底物相互作用的影响，我们采用MM-GBSA方法计算了结合自由能和单个能量组分。结果表明，A355N、S356Y和D525N突变增强了α-L-鼠李糖苷酶与其底物的结合亲和力，这与我们的实验结果一致。比较单个组件导致绑定自由能（表3），可以得出结论，静电和范德瓦尔交互贡献最大的绑定强度的变化A355N和S356Y，而在D525N的情况下，除了静电和范德瓦尔交互，极救赎也发挥了重要作用。总的来说，MM/GBSA结合自由能分析与分子对接和动力学分析的结果完全吻合，发现最适活性温度下的结合能非常低，表明酶底物复合物稳定突变。

相互作用分析

对野生型和突变体模拟构象的相互作用分析表明，当A355N中355位的丙氨酸突变为天冬酰胺时（图3a，b），天冬酰胺的氨基酸侧链被扩展。由于空间位阻的影响，Ser356被向前推进。此外，底物pNPR与Ser356之间形成了水桥，增强了酶与底物之间的氢键相互作用，从而提高了酶在底物上的活性。因此，这些结果与之前报道的对接MD模拟研究的结果一致，其中氢键的形成增加了酶在底物上的活性。当S356Y中356位的丝氨酸突变为酪氨酸时（图3c，d），酪氨酸的苯基与底物pNPR的硝基苯基环之间形成了pi-pi堆积，增强了酶与底物之间的相互作用力，提高了酶的活性。

至于突变D525N，当天冬氨酸在525位置突变为天冬酰胺，如图（3e，f），即酸性负电荷氨基酸突变为极性不带电荷的氨基酸，Asn525附近的负电荷突然变成正电荷。键相互作用没有改变，但当地环境电荷的强烈变化导致酶的属性的变化，并可以证明酶的活性和热稳定性的增加，结果从Naito et al.（的催化领域的变化导致酶的活性和热稳定性的增加。

通过半合理设计方法，Asp525突变位于底物结合催化域5Å范围内（图1a，b），可以同时有效提高催化活性和热稳定性。结果表明，新的半合理策略可以提高酶活性和热稳定性。此外，作者的研究表明，底物结合位点周围的5Å范围是进行蛋白质工程突变以提高酶活性和热稳定性的有效候选者。

整理：高放

DOI: 10.1002/bit.27758