氮素是影响粮食产量的主要元素和基本成分，氮肥在作物的根、茎、叶中起着重要作用。青海大学研究团队研究了两个氮敏感型马铃薯品种在缺氮和足氮条件下的基因表达水平变化，并在生物期刊《BMC PLANT BIOLOGY》（IF=5.260/Q1）上发表题目为“Transcriptome analysis reveals multiple effects of nitrogen accumulation and metabolism in the roots, shoots, and leaves of potato (Solanum tuberosum L.)”的研究论文，揭示了在缺氮条件下，不同品种马铃薯的根、茎和叶片中与氮运输和积累相关的共表达基因和潜在途径，研究结果为今后马铃薯氮代谢和提高氮素利用效率的研究奠定了基础。

奥维森提供了转录组学测序及分析服务。

研究背景

马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界范围内重要的栽培和肥料密集型作物，是重要的食物来源之一。氮(N)是多种细胞元素的组成部分。叶片缺氮会降低植物的生长发育，限制植物生产力。前人研究表明，在高氮环境下，根系生物量和根长密度会增加，在低氮环境下，芽-根生长调节剂的运输会提升，从而促进根系伸长。因此，了解马铃薯的氮素响应性和有机现象对提高氮素利用效率具有极大的意义。

研究方法

材料：两个氮敏感型马铃薯品种Q9和65

处理：两品种进行施氮处理，分为缺氮组（N0）和足氮组（N1）。

方法：RNA-seq、WGCNA、qRT-PCR

研究思路：

研究结果

1、施氮处理影响马铃薯植株形态

N处理对马铃薯品种Q9和65的植株形态均有影响。分别在N0和N1处理下测定其生理生化指标，发现N0组的两个品种株高均比N1组低；叶绿素含量及SPAD的变化规律与株高基本一致；足氮处理提高了Q9和65马铃薯叶片叶绿素的积累量；叶片干物质和氮积累量均高于根和茎；Q9干物质和氮积累量均高于65，说明Q9的氮素利用效率高于65，土壤对氮的吸收和转运从根系转移到茎，并在叶片中积累。

图1 两个马铃薯品种的生理生化参数

2、 转录组DEGs鉴定

对Q9和65两个品种的根、茎、叶做N0和N1处理，并进行差异分析，转录组结果显示：N0处理导致大多数基因在Q9和65的根、茎和叶之间差异表达。按照根、茎和叶进行组别划分，venn图显示，叶比较组共有的DEGs最多，其次是根，茎比较组共有的DEGs最少。结果表明，Q9和65的叶片更容易受到N营养变化的影响。

图2 N0和N1处理下两个马铃薯品种的根(R)、茎(S)和叶(L)的差异表达基因(DEGs)

3、GO功能富集分析

GO富集分析显示，在生物过程中，差异基因主要富集在“有机氮化合物代谢过程”、“磷酸盐及含磷酸盐化合物代谢过程”、“磷酸化”等GO term；在细胞组分类别中，差异基因主要富集在“细胞”、“膜”和“含有叶绿体和类囊体的质体”等GO term；在分子功能类别中，“结合”是最主要富集的GO term。选取的116个关键基因主要富集在“光合作用(包括PS I和PS II)”、“膜”、“叶绿体”和“叶绿素结合”等GO term。结果表明，氮的含量高低影响了光合过程、氮转运和代谢过程。根系也通过感知来自地面的光信号，建成适应不同光信号的生长过程。

图3 N0和N1处理下Q9号和65号马铃薯根(R)、茎(S)和叶(L)中DEGs和中心基因的GO富集

4、KEGG通路富集分析

KEGG功能分析结果显示，包含“次生代谢产物的生物合成”、“光合作用天线蛋白”、“植物激素信号转导”和“烟酸和烟酰胺代谢”等多种重要途径被富集。“次生代谢产物和氨基酸”代谢途径中的DEGs，在根中显著富集，“ABC转运蛋白”、“次级代谢产物”、“黄酮类”、“单萜类”、“淀粉和蔗糖”以及“维生素生物合成和代谢”相关DEGs在茎中显著富集，而“类胡萝卜素生物合成”、“其他色素”和“光合作用”等通路相关DEGs在叶片中显著富集。这些结果表明，功能基因的差异表达可能影响马铃薯不同组织的多种代谢途径。

5、WGCNA分析

通过加权基因共表达网络（WGCNA）分析，获得与叶绿素含量、干物质质量、氮素含量等表型性状相关的候选关键基因或hub基因。共得到23个不同颜色标记的模块，其中3个模块(MEturquoise，MEdarkorange，MEgreen)与上述各种表型性状均显著相关，并且三个模块的特征基因都是保守的，对进一步的挖掘和分析具有重要意义。

图4加权基因共表达网络分析(WGCNA)对基因表达量及相关性状进行分析

对显著相关的3个模块中116个Hub基因和DEGs进行了分析。模块1（MEturquoise）的DEGs从根到茎再到叶逐渐上调，模块2（MEdarkorange）的DEGs从根到叶下调，模块3（MEgreen）的DEGs在茎中上调，在根和叶中略微下调。对116个DEGs进行KEGG富集分析，发现19个DEGs富集在光合天线蛋白途径，46个DEGs富集在代谢途径，8个DEGs富集在氮代谢途径。其中，NR、NRT、NIR、NIRA、GS、GDH、CA和甲酰胺酶等8个DEGs都在与氮代谢相关的甲烷代谢、乙醛酸代谢和谷氨酸代谢中发挥重要作用。这些DEGs及其功能对马铃薯氮素利用效率和性状变异至关重要。

图5 筛选出的116个DEGs参与氮的吸收、转运和生物合成代谢

6、qRT-PCR验证

通过qRT-PCR选择参与光合、氮代谢、叶绿素和激素代谢的14个关键DEGs进行验证。4个DEGs在根中表达上调，2个DEGs在茎表达上调，其他8个DEGs在叶片中均表达上调，与RNA-seq结果趋势一致。

图6 对N0和N1条件下马铃薯根系(R)、茎(S)和叶部(L)的14个DEGs进行qRT-PCR验证

研究结论

在缺氮和足氮条件下对两个氮敏感型马铃薯Q9、65进行盆栽栽培。缺氮条件下，作物株高、叶片叶绿素含量、干物质含量和氮积累量显著降低。此外，对表型和转录组中GO term和KEGG通路进行了全面分析。通过WGCNA分析将涉及光合作用、氮代谢和次生代谢产物的116个DEGs，生成23个模块，并选择6个NRT基因、4个色素基因、2个生长素相关基因和2个能量相关基因进行qRT-PCR验证。研究表明了不同品种马铃薯的根、茎和叶片中与氮运输和积累相关的共表达基因和潜在途径。本研究为进一步研究提高马铃薯氮素利用效率提供了新的思路。

参考文献

Guo H, Pu X, Jia H, Zhou Y, Ye G, Yang Y, Na T, Wang J. Transcriptome analysis reveals multiple effects of nitrogen accumulation and metabolism in the roots, shoots, and leaves of potato (Solanum tuberosum L.). BMC Plant Biol. 2022 Jun 9;22(1):282. doi: 10.1186/s12870-022-03652-3. PMID: 35676629; PMCID: PMC9178895.