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每一个细胞里，无数马达蛋白（例如肌动蛋白、动力蛋白和肌球蛋白）一刻不停地沿着它们的蛋白轨道移动。得益于成熟的DNA折纸技术或化学合成手段，实验室构建的可动分子（mobile molecules）的运行轨道主要由DNA双链或化学合成的长链分子所组成。蛋白分子因为其3D结构的复杂性，一直未能被用于搭建可供化学分子移动的轨道。图1. 生物可动分子与化学可动分子都可以在蛋白轨道上移动。牛津大学的Yujia Qing课题组在蛋白纳米孔内，利用β-多肽链的平面结构构建了一条小分子运行轨道（图1）。该轨道目前由6个半胱氨酸基团组成，可供巯基分子在轨道上通过交换反应（thiol-disulfide interchange）进行逐步亚纳米尺度的移动。多肽轨道所在的α-溶血素（αHL）提供了一个稳定的β-桶状跨膜蛋白结构域。半胱氨酸的侧链巯基在去质子化后成为强亲核基团，保证了快速可逆的化学反应，使得分子能够在以秒计的速度下进行移动。利用电流检测手段，该分子移动可被实时观测。在最新的工作中，通过与Hagan Bayley课题组和Fernanda Duarte课题组的合作，巯基多肽分子轨道的反应活性被进一步评估，通过工程化改造周围的蛋白环境， 更快的分子移动成为可能。文章近期在Angew. Chem. Int. Ed.上线，第一作者为薄宗婳与Zhong Hui Lim。作者们首先在单分子水平上以硫醇-二硫键交换反应作为模型反应测量了每一个半胱氨酸的反应活性，通过pKa值以及完全质子化时的反应速率作为定量表征。具体来说，作者利用磷脂膜对二硫化物与硫醇进行空间分离，通过三步连续硫醇-二硫键交换反应构成一个循环，进行重复循环的单分子反应速率采集（图2）。作者发现，在一个近乎平面的蛋白环境中，成轨道的半胱氨酸被发现pKa值在9.17到9.85之间，存在约0.6个单位的差别，模型反应速率可相差近20倍。这反映了半胱氨酸巯基活性对周围环境的敏感性，符合它作为生物体内常见的活性基团在不同蛋白结构内呈现出来的巨大活性差别。例如，酶的活性位点中的半胱氨酸pKa值可低于5，而普通蛋白表面半胱氨酸pKa值一般在8-10范围内。图2. 单分子活性表征与蛋白工程提升巯基轨道活性。在之前野生型蛋白架构下，113位点上的半胱氨酸的反应速率最低。作者们接着尝试通过蛋白工程调节轨道内半胱氨酸的反应活性。在该半胱氨酸周围的点突变可以促成模型反应速率5.5倍的提升。在这个局部提升活性改造后的分子轨道上，负载了单链DNA货物的巯基移动分子在限速步上提速3倍。配合反应溶液的pH值的提升，在一个5个半胱氨酸组成的轨道上的分子运动的总体时长从59秒降低到14秒。综上，该工作中Yujia Qing团队通过系统的化学反应活性分析、蛋白工程改造、以及分子动力学模拟，揭示了多肽轨道组成基团的化学活性对周围的氨基酸侧链敏感的特性。轻微的蛋白环境改变（比如单个点突变），尽管只有极小的能量改变，就可以使化学反应以及分子移动的速度成倍增加。Mobile Molecules: Reactivity Profiling Guides Faster Movement on a Cysteine Track Zonghua Bo, Zhong Hui Lim, Fernanda Duarte, Hagan Bayley, Yujia QingAngew. Chem. Int. Ed., 2023, DOI: 10.1002/anie.202300890点击“阅读原文”，查看 化学 • 材料 领域所有收录期刊