色谱方法开发时，一般选择常用的试剂、pH条件、缓冲盐、以及常用色谱柱的组合作为起始条件，然后对流动相比例进行一系列调整，直至获得比较满意的峰形和分离效果，如何正确科学地选择液相流动相呢。
为了节省时间、资源，流动相作为对选择性影响最大、因而也是最重要的条件因素之一，应首先被筛选。而通过与其他因素的相互组合下，进行优化或微调，获得最终想要的结果。
对最终的方法进行验证，检查它是否满足预期的分离效果和分析目的。
一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。
一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。选择流动相时应考虑以下几个方面：①流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。②纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。③必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。④粘度要低（应<2cp）。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相。⑤对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。当分析物含有可电离官能团时，（在不同pH条件下可处于不同程度的电离状态，如伯、仲、叔氨基、羧酸基），pH条件将强烈影响分析物的反相保留状态，也会造成最强烈的选择性改变效果。对于可电离的化合物，要获得最强的反相保留，分析物应尽可能的不带电或电离，此时分析物极性相对较小，在反相色谱柱上的保留就更强，中性化合物无任何可电离基团，不受pH影响。酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反向保留最大，中性化合物的保留不受pH影响。在选择流动相时，应避免在化合物分子的pKa值附近筛选pH条件，否则，pH值的微小变化都会导致保留和选择性的剧烈变化。采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。(三乙胺triethylamine 氨分子中的氢原子被3个乙基取代的产物。分子式(CH3CH2)3N。易挥发的无色液体，有氨的气味。熔点－114.7℃，沸点89.3℃，相对密度0.7275（20／4℃）。溶于水和乙醇、乙醚等有机溶剂。三乙胺有碱性，与无机酸能生成易溶于水的盐类。可由N，N- 二乙基乙酰氨与氢化铝锂反应制取，也可用乙醇胺进行气相烷基化反应合成。用于制橡胶硫化促进剂、润湿剂和杀菌剂等，也可用作溶剂和用于合成四级铵化合物。)在选择缓冲液PH值之前，应先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka两个PH值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰，从HH公式：PH＝Pka＋log（[A-]/[A]）得知，溶液PH值高于或低于Pka两个单位，化合物中99％以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰。显示的是它的离子形式和中性化合物的转变，苯甲酸的Pka等于4.2，理论上由HH公示得知，当溶液PH值等于2.2时，99％的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等于6.2时99%的苯甲酸以离子形式存在，所以当缓冲液PH值等于2.2时，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱，表1列出了一般缓冲液和他们的缓冲范围。从表1知磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液能用于PH值等于2.2。当化合物只有氨基时，缓冲体系的选择十分简单，大多数氨基化合物在PH值小于9时都被质子化，所以所有PH值在7或更低的溶液均适合应用，你也许会问水的PH值大约是7，为什么还用缓冲盐，因为缓冲盐有助于增加方法的可靠性，以及色谱峰的尖锐性，PH值的降低有助于氨基化合物保留的减弱，减小化合物与硅胶表面硅羟基的作用，而使峰更尖锐，从表1 可值，任何缓冲液均可应用于氨基化合物的分析，但我们认为PH值等于3的磷酸钾盐最适合用于氨基化合物的分析。在上面两个例子中，PH＝3的磷酸钾盐都能获得良好的应用，在一般情况下，它是含羧基和氨基化合物分析中最好的缓冲液，并且我们认为在氨基化合物分析中钾盐比钠盐更好。甲醇和乙腈是反相分离的常用典型有机溶剂，除了洗脱强度、粘度（与柱背压有关）、紫外吸收性不同，甲醇与乙腈在化学选择性上也有所不同，甲醇可以发生氢键作用因此会提供显著不同的选择性。TIPS:根据实际情况，有时使用混合流动相会有很好的效果！我们选择的流动相、配制样品的稀释剂一定要是互溶的。经典的溶剂之间互溶表如下：优化：使用与初始流动相比例接近的溶剂，减小进样量，增大样品浓度。
科学指南针一测试万事屋
干货丨资讯丨教程丨视频
课件丨文献下载丨测试服务