今天推送的文章是发表在ACS Catalysis上的“Multiple Substrate Binding Mode-Guided Engineering of a Thermophilic PET Hydrolase”，通讯作者是来自中国科学院天津工业生物技术研究所的刘卫东研究员和德国格赖夫斯瓦尔德大学生物技术与酶催化系Uwe T.Bornscheuer教授等人。
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是合成聚酯中含量最丰富的一种，广泛应用于包装和纺织行业。最近，PET产量达到每年8200万吨，这对全球固体废物流和环境塑料污染造成了重大影响。生物催化回收PET已成为一种很有前途的技术，可在实验室和中试工厂规模上回收单体构件。
LCC是从叶枝堆肥超基因组库中分离得到的，是研究最广泛的嗜热PET水解酶之一。基于结构的LCC蛋白工程产生了F243I/D238C/S283C/Y127G变体（LCC ICCG）可以在72°C的条件下在10小时内有效地解聚PET。中温IsPETase（Tm为48.7°C）也已经过蛋白质工程以提高其热稳定性。例如，崔等人使用计算策略设计DuraPETase，这是一种Tm 提高31°C的变体，与野生型酶相比，PET水解活性显著提高。最近，机器学习辅助方法被用于设计 IsPETase 以生产Fast-PETase，这是一种Tm为 67.1°C 并提高解聚效率的变体。
深入了解不溶性聚合物底物与生物催化剂的结合机制和非共价相互作用有助于设计更有效的 PET 水解酶。到目前为止，只有两项研究报告了用PET类似物浸泡过的晶体结构。一种是与 1-（2-羟乙基） 4-甲基对苯二甲酸酯 （HEMT） 复合的无活性 R103G/S131A IsPETase 突变体的结构。另一个是与单（2羟乙基）对苯二甲酸酯（MHET）复合的 LCC ICCG 的无活性S165A突变体的结构。因此，需要更多具有结合底物类似物的PET水解酶结构。这将使更精确的计算模拟能够阐明酶解聚机制和预测更有效的突变体。到目前为止，研究主要依赖于计算模拟的PET底物构象。因此，作者解决了与 PET 类似物复合的两种 PET 水解酶的晶体结构。
两种高度相似的高温PET水解酶（PES-H1和PES-H2）最近在一项专利申请中被披露。PES-H1在无定形PET膜上显示出优异的水解性，在相同条件下表现出比野生型LCC更好的性能。在70℃孵育24小时后，几乎完全解聚。作者首先解决了这两种酶的载脂蛋白形式的高分辨结构（PDB：PES-H1：7CUV，PES-H2：7W69）。作者还解决了PES-H1的另一种晶体结构（在出版物中称为PHL7，PDB代码：7NEI）。通过浸泡各种PET底物类似物，作者获得了PES-H1和PES-H2与这些配体形成的配合物的结构。这些结构被用来通过分子动力学模拟来探索底物结合模式。最后，产生了PES-H1变种，在降解无定形PET（Gf-PET）薄膜和PET废物上的活性都有显著改善。这些变异株的表现优于野生型PES-H1和LCC ICCG。
PES-H1和PES-H2的结构。PES-H1和PES-H2的晶体结构分别在P21和C2空间群中以1.45Å和1.56Å的原子分辨率进行了解析。PES-H1和PES-H2只有四个残基（A/E1、L/F209、D/N232和S/A254）不同，其中只有L/F209残基与催化三联体非常接近（图1）。这两种水解酶具有相似的结构，采用典型的α/β-水解酶折叠，其核心由9个β-折叠和10个α-螺旋组成。PES-H1的载脂蛋白结构与其他细菌PET水解酶的结构相比，RMSD值较低。这些高度保守的结构形成了α/β水解酶超家族的一个独特的亚类。PES-H1具有由S130、H208和D176组成的催化三联体（图1）。亲核试剂S130位于要被碱基H208极化的氢键距离内，碱基H208又被酸D176稳定。PES-H1形成结构相似的同源酶的分子内二硫键，这个保守的二硫键（C241/C256）连接了最后一个β-折叠之间的两个环。
图1
底物类似物和降解中间体的结合模式。虽然PDB数据库中有70多种细菌PET降解酶的晶体结构，但大多数是没有底物结合的载脂蛋白结构。为了研究PET的水解机理，作者解决了PES-H1与柠檬酸盐的络合物以及与非水解性底物类似物4-（2羟乙基氨基甲酰基）苯甲酸（MHETA）的结构，以更好地了解基于该类似物结合PET底物时蛋白质结构的变化。还解决了PES-H2与聚乙二醇6000和双（2羟乙基）对苯二甲酸酯（BHET）的络合物的结构。根据PES-H1（与MHETA结合）和PES-H2（与BHET结合）的结构，确定了6种配体结合模式。底物结合腔中配体的取向是不同的，但类似于与IsPETase R103G/S131A（PDB：5XH3；图2I）结合的HEMT和与LCC ICCG23的S165A变体（PDB：7VVE；图2H）结合的MHET。
当LCC ICCG S165A（图2H）和IsPETase R103G/S131A（图2I）的结构显示出有效的配体构象时，酯羰基与催化丝氨酸残基的氧相互作用，而PES-H结构显示出多种非催化中间结合模式（IBM），其中酯键（或MHETA中的酰胺键）离S130太远，不利于亲核攻击。MHET和BHET经常被发现抑制酶催化的PET解聚。多个IBM表明，这些抑制降解的中间体在底物结合槽中滞留的可能性增加，在那里它们可能阻止聚酯链段的有效结合。
图2
活性中心周围以疏水残基为主的构象灵活性可能有助于在生物催化过程中识别和结合笨重的PET底物。在LCC ICCG S165A（图2H）和IsPETase R103G/S131A（图2I）的酶−底物复合体结构中，底物类似物的芳环分别T-堆积到W190和W156。在PES-H1结构7W6C（图2B，F）、7W60A（图2C）和7W6QA（图2D）中发现了类似的π-堆积相互作用。在大多数MHETA配体的IBM中（图2B−F），乙醇胺部分的羟基末端指向催化三元化合物。这部分与7VVE（图2H）中所示的MHET构象一致，而不是与IsPETase R103G/S131A（5XH3；图2I）结合的HEMT的乙二醇基（EG）部分的位置。MHETA配体还与其他疏水残基如F62、I178和L209在PES-H1的结合槽中相互作用。M131和F62的主链氨基形成氧阴离子空穴，这是许多α/β-水解酶的共同特征。结构中的对苯二甲酸酯（TPA）部分位于F62附近（相当于LCC ICCG S165A中的Y95和IsPETase R103G/S131A中的Y58，而不是像IsPETase R103G/S131A（图2I）和LCC ICCG S165A（7VVEA；图2H）中那样靠近催化三元组。此外，乙醇胺部分的羟基末端与H184形成氢键（图2C，D）。在7W6OB（图2E）中观察到PES-H1中唯一明显的MHETA结合模式，其中MHETA结合在PES-H1的表面，略高于催化腔。这种绑定模式表明在更深地进入活性部位空腔之前，底物可以结合在表面。BHET与PES-H2的结合更加松散（图2G）。它嵌入在由S130、H207、W155、I178、H129、F62和M131组成的凹槽中。与MHETA在PES-H1中的位置相反，TPA和EG部分之间的酯键更接近S130，但仍在催化距离之外。TPA部分接近F62，但远离W155。第二个EG部分完全暴露在溶剂中，与任何残基没有明显的相互作用。
分子动力学模拟研究PES-H1与PET低聚物的相互作用。为了更好地了解PET水解的机理，在由三个重复的PET单元组成的建模低聚物（3PET）的复合体中对PES-H1进行了MD模拟，以类似于较长的聚合物链段的结合。PES-H1在MD模拟中保持稳定，在100 ns的时间尺度上，与晶体结构相比，稳定的低主链RMSD小于1Å。模拟的PES-H1-3PET络合物对应于氧阴离子空穴酰胺与中心3PET羰基氧原子之间的距离较短（2.32和1.80Å），以及3PET中酯的羰基碳与催化剂S130的侧链氧（2.32Å）之间的距离较短的生成状态。在三个独立的100 ns MD模拟中，3PET羰基碳到催化剂S130的稳定距离验证了所建低聚物的生产状态。尽管如此，3PET在PES-H1结合部位略有弹性。为了确定最有利的 3PET 结合模式，我们将轨迹连接起来并对 3PET 构象进行聚类。共有四种首选的结合模式，评估四种结合姿势的相互作用能表明，侧链和中心 3PET 单元之间的疏水 Lennard-Jones （LJ） 相互作用对结合具有主要影响。F62、W155 和 I178 形成强 LJ 相互作用（<-10 kJ mol-1），当考虑总相互作用能时，G61、H129 和 T157 也被确定为强 PET 结合残基 （<-7 kJ mol-1）。
工程PES-H1用于提高非晶 PET 薄膜的热稳定性和活性。作者研究了72°C下的酶促PET降解，因为它是参考酶LCC ICCG水解非晶化PET废物的最佳温度。经验数据表明，PET水解酶的Tm通常比Topt高至少12°C。因此，Tm超过85°C的生物催化剂是高效降解 PET 的首选。在1M磷酸钾缓冲液中，之前的研究证明该缓冲液对于选定酶降解PET是最佳的。PES-H1的Tm增加到85°C从而使其能够在72°C下应用。由于高盐浓度不适合工业过程，研究了PES-H1在较低磷酸盐缓冲液浓度下对Gf-PET膜的降解。结果表明，缓冲液浓度与野生型PES-H1在72℃下的PET降解性能呈正相关，这很可能是由于较低缓冲液浓度下PES-H1的热稳定性降低所致。
图3
已发现许多同源PET水解酶，包括 PES-H1 本身，在Ca2+离子存在下是稳定的，表现为Tm增加、PET 水解活性提高或两者兼有。Ca2+结合可通过以下方式介导几个带负电荷的残基。例如，来自绿色糖单孢菌的同源 Cut190 中的 D250 和 E296 通过晶体学研究被鉴定为参与Ca2+结合（图3B）。Ca2+可以通过缓冲离子（如磷酸盐）以及 PET 水解产物对苯二甲酸酯沉淀，使得 PET 水解酶稳定性对Ca2+的依赖性不理想。这种依赖性可以通过用二硫键替换Ca2+结合残基来显著减轻，从而产生在不存在Ca2+的情况下热稳定的变体。因此产生了R204C/S250C变体。这一变体的Tm增加了6.4°C（图3L）。在72°C下24小时后，野生型和R204C/S250C变体的PES-H1几乎完全分解了Gf-PET膜（98%解聚）（图4A）。
将PES-H1结构（PDB代码：7CUV，图3E）与热稳定的DuraPETase（PDB代码：6KYS，图3F）进行比较，以确定更多的突变热点。利用Rosetta能量计算，根据DuraPETase中存在的L117F/Q119Y突变，构建了PES-H1的L92F/Q94Y变体。PES-H1的L92F/Q94Y变种具有高1.8°C的Tm，在72°C下24小时后几乎可以完全解聚GF-PET膜（图3L和4A）。有趣的是，通过去除酪氨酸残基（Y127G），LCC ICC被转化为更有活性的LCC ICCG，而将等效的酪氨酸引入PES-H1（Q94Y）与L92F结合导致活性增加。在PES-H1的最佳条件下，L92F/Q94Y变种的PES-H1在各种PET材料的水解方面优于LCC ICCG（图4A，B）。将前面讨论的二硫桥（R204C/S250C）引入L92F/Q94Y变体，以产生PES-H1的L92F/Q94Y/R204C/S250C变体。尽管该变种的Tm增加了4.8°C，但由于其对GF-PET薄膜的水解率低于野生型PES-H1（图3L），因此没有得到进一步的表征。
在 PES-H1 和 PESH2 之间不同的四个残基中，只有 L209 靠近活性位点（图1和3G）。由于该位点与聚合物底物的潜在相互作用，该位点已多次被认为是其他同源 PET 水解酶的工程热点。对 L209 位置进行饱和诱变，发现大多数变体（L209K、L209R、L209E、L209P 和 L209I 除外）导致热稳定性增强。对于 L209W、L209F 和 L209Y 变体，50 mM 磷酸盐缓冲液中的最高 ΔTm范围为 3.3 至 3.7°C（图3L）。然而，这些变体的 PET 水解活性降低了 15% 以上。这一重要残基的作用仍不完全清楚，它可能在不同的PET水解酶中发挥不同的作用。
此外，作者设计了几个可能参与与 PET 强相互作用的关键残基，如 PES-H1 和 PES-H2 与PET类似物复合的结构（图2）和 MD 模拟所示。其中包括 F62（图2B-D、G）、W155（图2B-D、F、G）和 I178（图2E）。F62 是氧阴离子空穴的一部分。除了 PES-H1、Cut190, 和 Tcur1278之外，其他已知的同源 PET 水解酶在该位置具有酪氨酸。将这种酪氨酸引入 PES-H1 （F62Y） 可极大地降低水解活性但对Tm没有影响（图3L）。对于 F62A 变体也观察到相同的效果。
PES-H1的W155残基相当于IsPETase的W185残基。IsPETase的W185（图 2I 中的 W130，由于 5XH3晶体结构中的残基编号不同）是灵活的，可以移动以打开或关闭对活性位点的访问。这种摆动有利于中温PET水解酶，因为PET聚合物链具有在环境温度下较低的链迁移率，而灵活的W185可以促进底物结合。这种动态色氨酸在许多同源PET水解酶中是保守的，并与 PET 的芳环发生强烈相互作用。将PES-H1的W155 替换为A、F或H，导致几乎完全丧失活性并显著降低稳定性（图 3L）。相比之下，嗜热LCC ICCG中相应 W190（图 2H）的构象通过与H218和F222（PES-H1中的H184和F188，图 2C、D、F）的相互作用来固定。因此，LCC ICCG 具有更刚性的底物结合槽，但由于聚合物链流动性增加，它仍然允许PET在高温下结合。
比较选定PES-H1变体对不同PET材料的水解活性。使用不同的PET材料进一步研究了 PES-H1的L92F/Q94Y和R204C/S250C变体。LCC ICCG 野生型PES-H1用作参考酶。这两种酶表面带电氨基酸的不同分布可以解释它们缓冲液需求的差异。与ES-H1 比，LCC ICCG低磷酸盐缓冲液浓度（100 mM）下不会失去其热稳定性和 PET 降解活性。但是，较高的磷酸盐浓度（高达 1 M）不会降低野生型的 PET 水解活性。由于1 M磷酸盐缓冲液对于PES-H1的活性和稳定性而言是最佳的，同时不会对 LCC 产生负面影响，因此将这种缓冲液用于所有后续的PET降解实验。如图4A所示，野生型PES-H1和L92F/Q94Y 变体在72°C下24小时内完全解聚Gf-PET薄膜。确定了孵育 12 小时后的重量损失，使用 L92F/Q94Y 变体获得了最高的 37.1 mg （62.4%） 的重量损失，这比野生型PES-H1高2.3倍。L92F/Q94Y变体在Gf-PET薄膜的水解中也显着优于R204C/S250C变体和LCC ICCG（图4A）。分别使用野生型PES-H1和LCC ICCG获得2.5 mgPETh-1和2.3 mgPETh-1的平均转化率。
图4
在72 ℃ 24 h后，PES-H1、L92F/Q94Y、R204C/S250C和LCC ICCG对低结晶度（13%）微粉化废旧PET粉末的降解性能与Gf-PET薄膜相当。L92F/Q94Y 变体产生的降解产物分别是野生型PES-H1和LCC ICCG的2.9倍和2.2倍（图 4B）。这表明，在应用的降解条件下，L92F/Q94Y 变体是最活跃的lcPET水解酶。R204C/S250C变体在水解lcPET材料中与野生型 PES-H1一样活跃（图 4A，B）。然而，R204C/S250C变体对hcPET 材料的活性明显低于野生型（图 4C，D）。相比之下，L92F/Q94Y 变体比野生型 PES-H1对hcPET粉末更有效，形成多达 3.4 倍的降解产物（图 4D）。对于通过不同预处理方法产生的水解 hcPET 粉末（图 4C、D），LCC ICCG 优于所有 PES-H1 变体，并且产生的降解产物比 L92F/Q94Y 变体高 4.0 倍（图 4C、D）。
在这项研究中，作者解决了载脂蛋白形式的嗜热酶PES-H1和PES-H2的晶体结构，尤其是与PET单体类似物MHETA和BHET的复合物。这使得能够识别六种中间结合模式和与PET 结合所涉及的几个关键残基。MD模拟支持这些残基参与PET结合。结构分析和先前确定的突变热点用于选择PES-H1残基进行诱变。鉴定了几种具有改善的热稳定性和PET水解活性的 PES-H1 变体。最活跃的 L92F/Q94Y 变体在水解 lcPET 材料（<15% 结晶度）方面优于参考酶 LCC ICCG。对于源自现实世界 PET 瓶废料的其他 hcPET 材料，其优于野生型 PES-H1 的活性也很明显。详细的结构分析提供了对界面生物催化机制的更好理解，工程变体有望用于生物催化塑料回收的未来应用。
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文章信息：
PMCID: PMC9361285
doi: 10.1021/acscatal.2c02275
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