原创Guo ZX 抗菌科技圈

第一作者：Yuhao Weng

通讯作者：Chia-Hung Chen & Hongliang Tan

通讯单位：香港城市大学，江西省师范大学

研究速览

近期，江西省师范大学的Yuhao Weng在Nature Communications上发表了有关用于伤口消毒的三磷酸腺苷激活智能施药杀菌系统。如今，前药方法已成为对抗细菌耐药性和增强对细菌感染的治疗效果的有前途的解决方案。该工作报告了一种用于按需治疗细菌感染的三磷酸腺苷 (ATP) 激活的前药系统。前药系统受益于ZIF-8和聚丙烯酰胺水凝胶微球的协同作用，可同时在单一载体中运输吲哚-3-乙酸和辣根过氧化物酶，同时防止吲哚-3-乙酸的过早活化。ZIF-8 的 ATP 响应特性允许前药系统被细菌分泌的 ATP 激活以产生活性氧 (ROS)，显示出卓越的广谱抗菌能力。当 ROS 破坏细菌膜时，死细菌泄漏的细胞内 ATP 可以加速前药系统的激活，从而进一步提高抗菌效率。

要点分析

要点一：巧妙地药物设计，在该研究中制造了一种三磷酸腺苷 (ATP) 激活的 HRP/IAA 前药系统，用于按需治疗细菌感染。这是通过基于液滴的微流控技术将负载有吲哚-3-乙酸 (IAA) 的辣根过氧化物酶(HRP) 和沸石咪唑酯骨架 8 (ZIF-8) (表示为 IAA@ZIF-8) 同时封装在聚丙烯酰胺 (pAAm) 水凝胶微球中来实现的。

要点二：ZIF-8 和 pAAm 微球的协同作用：在前药系统(HRP&IAA@ZIF-8@pAAm, HiZP) 中，ZIF-8 和 pAAm 微球的组合具有协同作用。 pAAm 微球为 HRP 和 IAA@ZIF-8 的共封装提供了生物相容性空间，以实现 IAA 和 HRP 在单个载体中的同时运输，而 ZIF-8 的尺寸选择性使预加载的 IAA 能够物理隔离从 HRP 避免其过早激活。此外，pAAm 微球由于其限制效应被证明可以提高 HRP 的稳定性和催化效率。

要点三：杀菌机制：由于 ATP 是活细菌分泌物，在实验中发现当 ROS 破坏细菌膜时，死细菌泄漏的细胞内 ATP 可以加速 HiZP 的激活，从而进一步提高抗菌效率。

图文导读

图 1. HiZP的制备过程和抗菌机制的示意图。 a 使用基于液滴的微流体技术制造 HiZP 的过程。 b ATP 触发的 HiZP 激活用于按需细菌灭活。 比例尺为 500 nm。

图 2. ZIF-8 对 ATP 的响应性。 FAM@ZIF-8（a）在用 ATP 处理之前和（b）之后的 SEM 图像。 比例尺为 1 μm。 SEM 图像代表具有相似结果的三个独立实验。 c 游离 FAM 和 FAM@ZIF-8 上清液在 ATP 存在下的发射光谱。 d FAM@ZIF-8 在相同条件下对 ATP 及其类似物的荧光响应。 e Salkowski试剂在不同条件下的吸收光谱。 f 用不同浓度的 ATP 处理的 IAA@ZIF-8 中 IAA 的时间依赖性释放曲线。 数据表示为平均值 ± SD（n = 3 个独立样本）。

图 3. HiZP 的表征。a HiZP 的光学图像。 该图像代表了具有相似结果的三个独立实验。 b 用 ATP 处理的 ZIF-8、pAAm、HiZP 和 HiZP 的粉末 XRD 图。 c 单独的 BCA 试剂和在游离 HRP、HiZP、pAAm 和 IAA@ZIF-8 存在下的吸收光谱。 d 基于 ABTS 比色法测定的游离 HRP 和 HiZP 的相对催化活性。 数据表示为平均值 ± SD（n = 3 个独立样本）。

图 4. ATP 触发的 HiZP 激活。 a 单独 DCFH 的发射光谱和在 HiZP 存在下的不同浓度 ATP 的发射光谱。 b 不同条件下 520 nm 处的 DCF 荧光。 c 在浓度为 0 至 5 mM 的 ATP 存在下，DCF 荧光在 520 nm 处的变化。插图是 520 nm 处 DCF 荧光强度对 ATP 浓度的线性图。 d 游离 HRP/IAA 系统和 HiZP 的相对 ROS 产量。数据表示为平均值 ± SD（n = 3 个独立样本）。通过 Tukey 多重比较检验的单向 ANOVA 分析统计显着性。

图 5. HiZP的抗菌能力。 a 不同处理后在 LB 琼脂平板上形成的金黄色葡萄球菌菌落图像。这些图像代表了具有相似结果的三个独立实验。 b 用不同浓度的 HiZP 处理的金黄色葡萄球菌的活力。 (c) 通过添加游离 ATP、不含金黄色葡萄球菌的新鲜培养基和含有金黄色葡萄球菌的培养基产生的吸收光谱。 d 存在 HiZP 混合物和用不同浓度碘乙酸处理的细菌上清液时 DCF 的发射光谱。 e 用游离 HRP/IAA 系统和 HiZP 处理的金黄色葡萄球菌的时间依赖性存活率。 HiZP 和游离 HRP/IAA 系统在 (f) 过量胰蛋白酶处理前后和 (g) 在室温下储存 14 天后对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。数据表示为平均值 ± SD（n = 3 次独立实验）。通过 Tukey 多重比较检验的单向 ANOVA 分析统计显着性。

图 6. HiZP的抗菌机制。 a 金黄色葡萄球菌在不同处理后的活/死荧光染色图像（比例尺 = 20 μm）和（b） SEM 图像（比例尺 = 500 nm）。绿色和红色信号分别表示活细菌和死细菌。 c DiBAC4(3) 在不同处理后染色金黄色葡萄球菌的荧光图像（比例尺 = 100 μm）。绿色信号表示细菌膜损伤（去极化）。 d 游离 DNA 和未经处理的金黄色葡萄球菌和用 HiZP 处理的金黄色葡萄球菌上清液的吸收光谱。 e 在用 HiZP 治疗金黄色葡萄球菌之前和之后 ATP 浓度的时间依赖性变化。 HiZP 对 (f) 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌和 (g) 抗安培金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌行为。比例尺为 500 nm。 (a)、(b)、(c)、(f) 和 (g) 中的图像代表具有相似结果的三个独立实验。数据表示为平均值±标准偏差（n = 3 次独立实验）。通过 Tukey 多重比较检验的单向 ANOVA 分析统计显着性。

图 7. HiZP 根除细菌生物膜。 a OD590 值用于评估用 HRP、IAA、HRP 和 IAA 的混合物以及 HiZP 处理后消除金黄色葡萄球菌生物膜的功效。 b OD590 值用于评估用不同浓度的 HiZP 处理后消除金黄色葡萄球菌生物膜的功效。 c 不同处理后残留生物膜的活/死荧光染色图像。 比例尺为 50 μm。 这些图像代表了具有相似结果的三个独立实验。 数据表示为平均值 ± SD（n = 3 次独立实验）。 通过 Tukey 多重比较检验的单向 ANOVA 分析统计显着性。

图 8. HiZP对小鼠模型的伤口消毒能力。 a 用 PBS、免费 HRP/IAA 系统和 HiZP 治疗的未感染伤口和金黄色葡萄球菌感染伤口的照片。 b 从镀在 LB 琼脂板上的伤口组织分离的金黄色葡萄球菌菌落图像。 c 每个样本的伤口组织中存活的细菌数量。 d H&E染色和Masson三色染色后皮肤组织切片的组织学显微照片。比例尺为 100 μm。这些图像代表了具有相似结果的三个独立实验。Dada 表示为平均值 ± SD（n = 3 次独立实验）。通过单因素方差分析和 Tukey 的多重比较检验分析统计显着性。

结论

在这项工作中，制造了一种 ATP 激活的 HRP/IAA 前药系统 (HiZP)，用于按需治疗细菌感染。

1. 在这项工作中ZIF-8 和 pAAm 微球的协同作用使 HiZP 能够在单个载体内同时运输 HRP 和 IAA，同时避免 IAA 过早激活。此外，作为一个完整的前药系统，与游离 HRP/IAA 系统相比，HiZP 的优势在于其显着提高的 ROS 产量和随后的抗菌活性。
2. 研究的前药系统与传统的 ROS 系统相比，HiZP 不需要有毒的 H2O2 来产生 ROS，并且在健康组织中保持无活性。同时，IAA 对哺乳动物过氧化物酶具有高度耐受性，不能像 HRP 那样氧化 IAA 生成 ROS。因此，通过使用 HiZP 作为前药系统，建立了一种副作用可忽略不计的按需方法，用于有效治疗细菌感染。
3. 通过研究发现在启动由细菌分泌的 ATP 产生的 ROS 后，可以通过死菌细胞内 ATP 的泄漏来加速 HiZP 的激活，进一步提高抗菌功效。从体内抗菌结果来看，证明了HiZP对伤口消毒的适用性。

因此，通过实验提出的前药策略不仅为解决传统 HRP/IAA 前药系统同时转运和过早激活的矛盾提供了一种强有力的方法，而且还为利用 ATP 作为代谢触发器开发按需抗菌剂提供了机会。

全文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-022-32453-3

参考文献：Yuhao Weng, Huihong Chen, Xiaoqian Chen, Huilin Yang, Chia-Hung Chen & Hongliang Tan.,Adenosine triphosphate-activated prodrug system for on-demand bacterial inactivation and wound disinfection. Nature Communications, 2022, 13, 4712

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