大家好，今天推送的文章是来自Nature Communications的“Crystal structures reveal catalytic and regulatory mechanisms of the dual-specificity ubiquitin/FAT10 E1 enzyme Uba6”，通讯作者为位于美国德克萨斯州圣安东尼奥的德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心生物化学与结构生物系的Shaun K Olsen。

泛素（Ub）和类泛素蛋白（UBL）作用于蛋白质的翻译后修饰（PTM），支持基本细胞过程的调节。Ub/Ubl结合需要包括E1、E2和最常见的E3的平行级联酶的活性，并依照顺序相互作用，共同激活、运送和连接Ub/Ubl至靶蛋白。两种人类Ub E1s，Uba1和Uba6，通过ATP的水解（腺苷化）与高能E1-Ub硫酯键（硫化）的耦合，决定着Ub的共轭级联的起始。然后将活化的Ub转移到不同的同源E2酶库（转硫酯化）。虽然Uba1对Ub活化具有特异性，但Uba6对Ub和FAT10具有双重特异性，且参与了有丝分裂进程、免疫和癌症的过程。

到目前为止，Uba6还没有进行结构表征，但大量研究表明，Uba1是一种大型多结构域酶，其中每个结构域在Ub腺苷酸化、E1~Ub硫酯键形成和E1-E2-Ub转硫酯化的催化过程中起着不同的功能作用。为了深入了解Uba6催化Ub/FAT10活化的分子基础，E1酶Uba6通过涉及腺苷酸化和硫酯键形成的两步顺序催化过程，激活泛素和泛素样蛋白FAT10启动信号转导。作者确定了人Uba6/泛素复合物的晶体结构，并观察到两种不同的复合物结构：（1）Uba6的开放构象中，活性位点被用于催化腺苷酸化；（2）而其封闭构象中，腺苷酸活性位点被分解并重新用于催化硫酯键形成。作者发现了六磷酸肌醇（InsP6）分子与Uba6上的一个先前未识别的异构位点结合，并结合结构、生物化学和生物物理数据分析得出，InsP6通过改变Uba6的开放和封闭构象的相互转换来抑制Uba6活性，同时也增强其稳定性。除了揭示Uba6催化的分子机制及其活性的变构调节外，对其结构的分析还为开发Uba6特异性抑制剂提供了框架，并提高了天然细胞代谢物对其他E1s进行变构调节的可能性。

Uba6/Ub相互作用与Uba1/Ub相似，为了深入了解Uba6对Ub和FAT10的双重特异性，进行了结构比较。在Ub和FAT10之间的许多差异区域中，Uba1激活Ub至关重要，并参与Uba6/Ub结构中疏水相互作用网络Ile44疏水性贴片（Leu8/Ile44/Val70）在FAT10中不保守（下图d-f）。在FAT10中，对应于Ub-Ile44贴片的区域（包括Ser95、Thr132和Ala159），已分化为极性更强的区域。因此，对于FAT10，Ub参与Uba1和Uba6的功能重要疏水接触网络不同。同时FAT10在β1-β2环中有一个双残基插入，该环靠近Uba6的AAD，并可能参与独特的相互作用（下图d-f），其在C端有一个独特的“CYCI”基序，在特异性方面发挥作用。最后，FAT10与Ub的不同之处在于，它包含两个串联的Ub样结构域（NTD和CTD），通过连接区连接（下图e），尽管位于离酶表面很远的位置，但对于Uba6激活FAT10至关重要。

SCCH结构域通过两个柔性环与Uba6的腺苷酸结构域相连。这些被称为交叉环，其包含催化残基半胱氨酸并通向SCCH结构域，将SCCH结构域连接回腺苷酸结构域（下图a）从而SCCH结构域旋转136°，将催化半胱氨酸转变为腺苷酸化活性位点，SCCH域交替伴随着交叉环的弯曲和再入环的正交弯曲（下图a）。在Uba6OPEN/Ub AMP结构中，催化半胱氨酸位于交叉环内的短螺旋（H18）上，而在Uba6CLOSED/Ub AMP结构中，H18融化成延伸环。这使催化半胱氨酸定向用于Ub-AMP的甘氨酰磷酸键的亲核攻击（下图a）。通过在UBA6CLOSED/Ub AMP结构中形成短β-链对（β23-β24），稳定交叉环的改变路径，该交叉环定位催化半胱氨酸进行硫化，而包含β23-β24的残基是UBA6OPEN/Ub AMP结构是柔性环（下图a）。同时Uba6（残基798-817）的cys帽从Uba6OPEN/Ub AMP结构中的有序状态转变为Uba6CLOSED/Ub AMP结构中的无序状态（下图a）。在Uba6OPEN/Ub AMP结构中，cys帽埋置Uba6催化半胱氨酸（下图a，b），可保护其免受氧化或化学损伤，从而降低活性。在Uba6CLOSED/Ub AMP结构中，SCCH结构域交替将cys-cap转变为与腺苷酸化的催化机制非常接近（下图c），避免使用开放构象引发严重的空间位阻。因此，巯基化过程中cys-cap的无序化有两个目的：增加催化半胱氨酸的溶剂可及性，从而增强反应效率；防止与封闭构象中的腺苷酸结构域发生空间冲突，促进了SCCH结构域的交替。

作者解析的结构为Uba6催化腺苷酸化和硫酯键形成的分子机制提供了以下解释。Uba6OPEN/Ub AMP结构中活性位点内的氨基酸序列表明，Ub Gly76的C端羧酸盐通过与Uba6螺旋H14的N端Gly469、Ala470、Ile471、Gly472的相互作用，于通过氢键和电荷互补催化腺苷酸化的过程中，与ATP的α-磷酸的亲核攻击相协调。建模表明，在腺苷酸化催化过程中，PPi离去基团由碱性和极性残基Arg46、Asn505、Arg508、Gln509和Lys521稳定。在腺苷酸化过程中，Mg2+稳定在亲核攻击过程中发生反转的α-磷酸，同时也可能减轻Ub-Gly76羧酸盐和ATP的α-磷酸盐之间的静电排斥。在释放PPi离开基团后，SCCH结构域的改变和活性位点的重塑分解了腺苷酸化的催化机制，并将其重新硫醇化。促使反应向前，同时防止逆反应。在这两种结构中，Ub AMP的Gly76的α-磷酸和C-末端羰基氧分别在腺苷化和硫化过程中受到亲核攻击，直接指向Uba6的螺旋H14的N-末端，这表明螺旋偶极子的电正性可能有助于稳定在腺苷化和硫化反应期间形成的过渡态和四面体中间体的负电荷。

此外，作者还观察到六磷酸肌醇（InsP6）分子与Uba6 SCCH结构域特有的进化保守、高度碱性结合口袋。在分辨率为2.25 Å的Uba6OPEN/Ub AMP结构中，于靠近H18和Uba6催化半胱氨酸的SCCH结构域表面较深的催化口袋中观察到较强的电子密度（如下图a）并基于其六重对称性和周围的化学环境，确定其为InsP6分子。InsP6的轴向磷酸盐参与与Lys644、Lys706、Lys70和Tyr710的氢键网络，而赤道磷酸盐接触Ser647、Lys652、Lys687、Arg691和Lys714，Trp640在组织结合袋中起结构作用（下图a，d）。同时cys帽覆盖InsP6分子也贡献了两个碱性残基Lys800和Lys810，它们参与与InsP6的三个赤道磷酸盐的直接和水介导接触（如下图a,d）。位于Uba6交叉环内螺旋H18上的催化残基半胱氨酸附近的Lys628也与nsP6的两个赤道磷酸盐接触。

与Uba6相比，Uba1中的等效区域具有显著不同的结构特征和表面静电（图3c）。这表明，与InsP6相互作用的能力已演变为Uba6而非Uba1的特异性特征。为了验证这一假设，使用等温滴定量热法（ITC）测量了InsP6的亲和力。结果表明，虽然细菌衍生的Uba6结合InsP6的KD值约41nM，但在相同条件下，Uba1无法检出结合（图3g）。作者还测试了Uba6与信号肌醇磷酸酯InsP3（D-肌醇1，4，5-三磷酸）和InsP5（D-肌肌醇1,3,4,5,6-五磷酸）结合的能力，它们都是InsP6的前体，并发现它们也能够与Uba6相互作用，尽管分别具有248nm和73nm的较高KD值（下图g）。使用ITC进行评估后，与InsP3和InsP5一致，它们各自缺乏对InsP6结合重要的轴向磷酸，包括Uba6的InsP6结合袋的Uba6残基突变为Uba1的相应氨基酸的六重突变体，完全消除了Uba6和InsP6之间的相互作用。综上所述，这些结果表明，InsP6结合是Uba6而非Uba1的特异性特征，Uba6的基本结合袋也能够结合其他信号肌醇磷酸酯，如InsP3和InsP5。由于在真核细胞内InsP6的浓度范围为10–100μM，Uba6对InsP6的高亲和力（~41nM）具有生理意义。

接下来，作者通过在添加与不添加50μM 的InsP6的情况下，测定Uba6~Ub和Uba6~FAT10硫酯键形成的预稳态动力学参数，检验了InsP6是否能够调节Uba6的活性。作者发现，尽管在存在和不存在InsP6的情况下，Ub和FAT10的米氏常数（Km）大致相同，InsP6存在时下，Uba6~Ub和Uba6-FAT10硫酯中间体形成的速率常数（kobs）约慢3-4倍（见下图a,b，见下表）。InsP6抑制Uba6~Ub和Uba6~FAT10，IC50值与使用ITC测量的Uba6/InsP6相互作用的KD一致。且InsP6未能抑制Ub和FAT10的Uba6_InsP6mut激活，也未抑制Ub的Uba1激活（图4c）。结果进一步证明，通过结合其SCCH结构域上的碱性口袋介导的InsP6的抑制作用对Uba6具有特异性。作者还使用E1~Ub/FAT10硫酯形成分析检验了InsP3和InsP5抑制Uba6激活Ub和FAT10的能力（下图d）。相对于InsP6，这些肌醇磷酸酯对Uba6~Ub和Uba6~脂肪酸10硫酯中间体形成的抑制显著减弱（下图d）。鉴于InsP3和InsP5结合Uba6时都表现出较高的亲和力，该结果表明InsP6的轴向磷酸在调节Uba6活性中起重要作用。

接下来为确定磷酸肌醇结合是否影响Uba6的整体和独立SCCH结构域变体的Uba6稳定性（下图e），作者进行了热位移的测定。结果表明，InsP6与Uba6 SCCH结构域的结合将其熔化温度提高，与昆虫细胞来源蛋白的熔化温度相似（图4e）。InsP3和InsP5对源自大肠杆菌的Uba6 SCCH结构域的熔化温度有不同程度的提高，而肌醇磷酸酯均不影响昆虫细胞源蛋白的稳定性（图4e）。任何肌醇磷酸盐均不影响大肠杆菌衍生的Uba6_InsP6mut SCCH结构域的热稳定性（下图e），这再次证明肌醇磷酸盐对Uba6的调节活性是通过结合SCCH结构区的基本口袋介导的。尽管由于Uba6的多结构域性质，熔化曲线更为复杂，但上述Uba6 SCCH畴的趋势在全长Uba6中类似。

作者对Uba6OPEN/Ub AMP和Uba6CLOSED/Ub-AMP结构进行分析，并提供了对InsP6与Uba6结合调节其活性和稳定性的分子机制的见解。数据表明，InsP6介导了：（1）SCCH结构域内的柔性环（cys帽，交叉环）的稳定，（2）开放构象中的SCCH结构区的稳定，并通过延伸，活性位点内的H1/H2和g6结构元件的刚性化，以及（3）通过将该结构域的两个瓣桥接在一起来稳定球状SCCH结构域本身。与单独的Uba6相比，这些特征共同有助于Uba6/InsP6复合物的热稳定性的显著增加。并可能解释了当在昆虫细胞中表达时，与在大肠杆菌中表达相比，重组Uba6的产量显著更高。

虽然作者的工作阐明了Uba6催化腺苷酸化和硫化的分子机制，也意外地揭示了由细胞代谢物介导的调节机制，但对这种酶仍有许多需要了解。这包括阐明磷酸肌醇的结合在调节细胞中Uba6的功能中的作用，以及其他细胞因子是否也通过结合SCCH结构域上的基本口袋以调节其活性。其他问题包括定义Uba6对Ub和FAT10的双重特异性的分子规则，以及阐明这些Ub/UBL转移到Uba6同源E2缀合酶Ube2Z的机制。在这方面，Uba6的InsP6结合位点与其SCCH结构域的预测E2结合表面重叠，需要确定InsP6是否在E1-E2-Ub转硫酯化中起到的作用。最后，Uba6/ Ub-AMP结构，特别是与人类Uba1活性位点的差异，可为针对这种酶专门用于癌症和其他疾病的治疗干预的药物开发工作提供一个框架。

整理：王鑫源

DOI: 10.1038/s41467-022-32613-5