点评 | 郭爱克（中国科学院院士）、骆利群（斯坦福大学）、钟毅（清华大学）

为了在瞬息万变的自然界中获得尽可能多的生存、繁衍机会，动物进化出了关联学习记忆的能力——将中性的条件刺激（conditioned stimulus，CS），与惩罚性或奖赏性的非条件刺激（unconditioned stimulus，US）关联起来——从而实现趋利避害的本能。

最经典的关联学习记忆范式莫过于俄国科学家伊万·巴甫洛夫（Ivan Pavlov；1904年诺奖得主）对狗进行的“铃声-食物”关联学习训练。巴甫洛夫发现经过“铃声-食物”关联训练的狗听到铃声即可预判食物的到来，从而提前分泌唾液。在他的学术著作《条件反射》一书中，巴甫洛夫写道：“A ... most essential requisite for ... a new conditioned reflex lies in a coincidence in time of ... the neutral stimulus with ... the unconditioned stimulus.” 他敏锐地注意到“时间”对于训练效果的重要性：如果铃声响起一个小时后放饭，狗不能学会两者之间的联系；只有当铃声和食物同时出现，狗才能够学会二者之间的关联。在真实情况中，铃声和食物之间并不是分秒不差地同时出现，而是有一定的时间间隔，研究者把能够有效关联CS和US的最大时间间隔称为“一致性时间窗口（coincidence time window）”。虽然巴甫洛夫首次观察并且记录下了这一现象，但是他并不清楚隐藏在其背后的生物学机理。

在巴甫洛夫首次记录“一致性时间窗口”之后的一百年中，科学家相继在人、海兔、果蝇、蜜蜂等不同物种的学习行为中观察到了类似现象，时间范围从几秒钟到一分钟不等。此外，临床研究发现，一些神经发育不良、神经损伤或者神经退行性疾病患者表现出时间认知障碍，在巴甫洛夫式学习记忆测试中“一致性时间窗口”出现缩短或者延长的异常情况。异常缩短的时间窗口会导致动物难以学会事物之间正常的关联；反之，异常延长的时间窗口会导致动物把原本不相关的事件联系在一起。

尽管有如此多跨物种、跨疾病的现象描述以及相关性实验，但针对“一致性时间窗口”本身，仍有众多未解之谜：如1）时间窗口长度是否可调？2）它是否影响学习记忆后突触的可塑性变化？3）它受到什么神经环路和分子机理的调控？

2023年1月26日，北京大学/深圳湾实验室李毓龙团队在Neuron期刊在线发表了题为 Local 5-HT signaling bi-directionally regulates the coincidence time window for associative learning 的研究成果，以经典的果蝇嗅觉学习记忆为范式，结合李毓龙验室开发的多种神经递质荧光探针，发现五羟色胺双向调节学习记忆的“一致性时间窗口”的新机理，并进一步解析了五羟色胺对突触可塑性的调节，及其发挥功能的负反馈神经环路。

在果蝇嗅觉学习记忆范式中，果蝇在“气味-电击”训练后会对特定气味形成恐惧记忆。早在1985年Tim Tully和William Quinn等人就已经发现，随着“气味”和“电击”的时间间隔增加，果蝇的学习效果逐渐变差。在此次研究中，团队成员利用T-迷宫装置复现了这个经典实验，通过系统性地改变时间间隔，测得果蝇的“一致性时间窗口”为16.9 s。当通过遗传学手段降低五羟色胺水平时，对应“一致性时间窗口”缩短。与之相反，通过抗抑郁药增加五羟色胺水平时，能够相应地延长时间窗口。由此，研究人员发现“一致性时间窗口”的长短并非固定不变，而是大脑中一个能够被五羟色胺水平双向调节的动态变量。

学习记忆的本质是突触可塑性变化，经典的电生理研究表明嗅觉学习记忆形成伴随着蘑菇体（mushroom body，果蝇的嗅觉学习记忆中枢）中KC（Kenyon Cell）和MBON（mushroom body output neuron）之间的突触抑制（synaptic depression）现象。团队成员利用该实验室开发的乙酰胆碱探针复现了这一研究结果，在此基础上发现“气味-电击”的时间间隔延长会导致可塑性变化消失，测量得到的“一致性时间窗口”为14.8 s，与行为学上16.9 s的数据极为相近。更重要的是，人为降低或者升高五羟色胺水平同样能改变时间窗口的长短，表明五羟色胺是通过调节突触可塑性，从而最终影响了学习行为。

在果蝇的大脑中，每个半球有且仅有一颗五羟色胺能DPM（dorsal paired medial）神经元投射到蘑菇体。团队成员系统地解析了DPM的上下游神经环路，发现KC释放的乙酰胆碱激活DPM，而DPM释放的五羟色胺对KC起到负反馈抑制作用。利用实验室开发的五羟色胺探针，该论文发现DPM在蘑菇体不同功能区的五羟色胺释放量并不均匀，而是呈现出空间特异性，五羟色胺局部水平差异赋予蘑菇体功能区不同的时间窗口。

图：五羟色胺能DPM神经元在蘑菇体中形成负反馈抑制神经环路，在突触可塑性和嗅觉学习记忆两个层面调节“一致性时间窗口”。（图源：J. Zeng, et al., Neuron, 2023）

经典的赫布理论（Hebb’s rule）将突触的可塑性变化解释为“Cells that fire together, wire together”。1997~1998年，这一理论被一系列经典的电生理实验证明，并进一步完善为脉冲时序依赖可塑性（STDP, Spike-timing-dependent plasticity）——突触前、突触后神经元同时兴奋会产生“资格痕迹（eligibility trace）”，使突触处于能够被改变、但尚未发生改变的状态，等待着第三个元素出现；第三个元素是由神经调制介导的惩罚或者奖励信号，它的出现最终决定突触可塑性变化的方向和幅度。但是这一理论并不完美，因为不清楚等待时间长短由什么元素决定。曾有科学家推论五羟色胺很有可能发挥了这一功能，此次研究通过实验证实了这一猜想，表明五羟色胺是赫布理论中被遗漏的“时间调节因子”。

这项工作围绕巴甫洛夫学习记忆范式中重要的“时间一致性”问题，发现了一个完整的神经环路模型，揭示了神经递质五羟色胺调节“时间一致性”的特殊角色，动物利用这一计时机制来判断不同事件之间的因果关系。该研究有助于理解神经疾病导致学习记忆障碍的病理机制，为药物干预患者的时间认知障碍提供新的见解。

北京大学生命科学学院教授/深圳湾实验室分子生理学研究所合作研究员李毓龙、深圳湾实验室分子生理学研究所博士后曾健智为共同通讯作者，曾健智博士和北京大学生命科学学院博士研究生李雪霖为共同第一作者，张任子墨、吕明月博士、王艺潘、谭柯、夏西聚、万金霞博士、张修宁、李瑜等对文章做了重要贡献。该工作得到了北京脑科学与类脑研究中心井淼团队、中科院生物物理所李岩团队（杨扬）、中科院深圳先进技术研究院储军团队（王亮）的通力合作。

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专家点评

郭爱克（中国科学院院士）

一个世纪以前，俄国科学家伊万·巴甫洛夫（Ivan Pavlov，1904年诺奖获得者）提出了经典的学习记忆理论模型“关联学习（associative learning）”，也被称为“条件反射（conditioned reflex）”：他以狗为研究对象，训练狗学会“铃声-食物”之间的关系，让狗一听到铃声便开始分泌唾液。巴甫洛夫注意到，除了“铃声”和“食物”之外，还有一个决定训练是否成功的关键因素是“时间一致性（coincidence）”——只有当“铃声”和“食物”同时出现、或者间隔很近时，训练才能成功；反之，当“铃声”和“食物”相隔很远时，学习记忆则不会发生。在巴甫洛夫的理论框架下，科学家们相继在不同的物种中发现，“时间一致性”决定了几乎所有学习记忆行为：诸如以人为研究对象的“铃声-眨眼”记忆；以海兔为研究对象的“触摸-电击”记忆；还有以果蝇为研究对象的“气味-电击”记忆。从巴甫洛夫的理论模型提出至今的一百年中，人们已经初步解析了大脑中“铃声”和“食物”等信息的编码方式，但是“时间一致性”的神经环路和分子机制始终悬而未决，成为了学习记忆领域的重要的科学难题。

李毓龙实验室以经典的果蝇“气味-电击”记忆为研究模型，找到了调节“时间一致性”的重要分子——神经递质五羟色胺。作者们结合自己实验室开发的多种神经递质活体检测技术，解析了五羟色胺调节“时间一致性”的神经元、神经环路及其调节机制。他们发现在果蝇精细的大脑中，每个半球仅通过一颗五羟色胺能神经元DPM来调节“时间一致性”的判断标准，从而决定两个事件是否在同一时间尺度内、是否应该发生联系，即联想式记忆是否形成。通过遗传学操纵DPM神经元的活性，能够人为地延长或者缩短“时间一致性”的长短，影响动物对时间的认知。学习记忆的物质基础是突触可塑性变化，作者们还进一步证明五羟色胺能够在突触可塑性层面上调节“时间一致性”，提出了“行为-环路-突触-分子”的完整框架，为回答巴甫洛夫遗留百年的重要问题开启了一扇窗口。

对哺乳动物学习行为的研究提示，五羟色胺调节了动物对时间的感知。比如服用精神类药物（五羟色胺受体激动剂）的动物和五羟色胺缺乏的患者在“时间一致性”上表现出相应的延长或者缩短现象，暗示五羟色胺很有可能作为一种进化上保守的“时间分子”。该研究揭示了五羟色胺在果蝇联想式学习中的关键意义，对进一步理解人类的学习记忆行为、对“时间一致性”的认知、对环境中不同事件相关性的判断 、对“万物互联”和智能演生等科学问题，必将产生广泛而深远的影响。

专家点评

骆利群（斯坦福大学教授）

This study identified a new and very interesting function for serotonin neurons and serotonin release: to modulate the window of associative learning in a well characterized learning and memory circuit in the brain of fruit flies. It will be very interesting to test whether serotonin in the mammalian brain play an analogous function.

翻译：该研究在了解已经非常透彻的果蝇学习记忆神经环路的基础上，发现了五羟色胺信号的一个全新、而且非常有趣的功能——能够调节关联学习记忆的时间窗口。非常期待在未来进一步研究五羟色胺是否在哺乳动物的大脑中发挥着类似的功能。

专家点评

钟毅（清华大学教授）

动物赖以生存的一个基本能力是学会建立普通环境刺激与随之而来的伤害性刺激之间的关联，从而有效地躲避未来可能出现的类似危险。这种关联学习要求两种刺激在时间上足够临近才能形成，即需要一个短暂的关联时间窗。大脑如何调控这个时间窗一直是一个未解之谜。

北京大学李毓龙课题组利用果蝇模型揭示了关联时间窗的神经调控机制。他们发现一对调控性神经元（DPM）对学习神经元（KC）的反馈性抑制环路是调控关联学习时间窗的关键。操控调控性神经元的五羟色胺（5-HT）神经递质的释放可以双向地调控关联学习时间窗的长短。此发现极大地推进了我们对关联学习底层机制的理解。

值得注意的是，此发现的取得依赖于课题组对自主研发的乙酰胆碱（ACh）和五羟色胺（5-HT）荧光探针的综合利用，充分展示了新工具对回答神经科学基本问题的显著推动作用。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.12.034

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