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专家点评|何川课题组揭示mRNA m6A甲基化区域选择性机理

日期: 来源:BioArt生物艺术收集编辑:BioArt生物艺术

点评 | 付向东 UCSD

杨运桂 中国科学院北京基因组所(国家生物信息中心)

陈玲玲 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心

责编 | 酶美、迦溆

N6-甲基腺嘌呤(m6A)是哺乳动物mRNA内部最常见和研究最为广泛的修饰,对于多种生理学和病理生理学过程中的基因表达有着广泛深刻的影响。在转录组中存在着数万个m6A位点,参与调控mRNA代谢的多个步骤,包括前体mRNA处理、转运出核、降解和翻译 【1, 2】。m6A经METTL3/METTL14甲基转移酶复合体特异性地催化组装在DRACH(D = A, G or T; R= A or G; H= A, C or U)序列上,但只有转录本上一小部分的DRACH序列(约5%)会被选择性甲基化【3, 4】。与此同时,m6A在转录组上的分布具有显著的区域选择性,主要是在异常长的外显子和终止密码子附近富集。特定转录本上的m6A甲基化使得“阅读”蛋白(YTH家族蛋白等)优先结合这些m6A标记的转录本从而调控其基因表达【3, 4】。

尽管m6A选择性甲基化对于m6A介导的基因调控具有关键性作用,但目前对这一选择性的机制仍缺少深入的理解。值得注意的是,大多数针对调控m6A甲基化选择性的研究都关注于选择性激活特定区域甲基化的机制。这些激活机制包括转录因子、RNA结合蛋白和组蛋白修饰物在局部招募甲基转移酶,以促进附近RNA序列的靶向甲基化 【5-10】。然而,已知的通路无法解释m6A在转录组特定区域(如长内部外显子和终止密码子附近)的整体富集以及很多具有m6A标记的转录本的选择性甲基化,因此控制m6A甲基化并赋予m6A表观转录组特异性的主要机制仍未被发现。

2023年1月26日,美国芝加哥大学何川教授团队在Science在线发表题为 Exon architecture controls mRNA m6A suppression and gene expression 的文章。该研究发现鉴定出由剪接体组装在外显子边界上游的外显子拼接复合体(EJCs)【11,12】作为m6A“抑制器”调控mRNA m6A的区域选择性,从而决定了整体m6A表观组分布特异性的多个关键特征。在小鼠和人类组织中,EJCs的表达和mRNA m6A甲基化水平负相关、通过m6A“阅读器”YTHF2的调控和对应mRNA的稳定性正相关。外显子体系结构(exon architecture)通过这个新机制影响mRNA稳定性, 调控基因表达。在进化层面外显子-内显子的体系结构在脊椎动物中通过m6A依赖的方式调节mRNA稳定性。这项研究发现还表明,外显子体系结构(exon architecture)通过对外显子结(exon junction)近端的mRNA包装广泛决定了mRNA调控机制对于局部RNA可及性(accessibility)。该研究对于解析mRNA m6A甲基化转录组的分布特异性以及外显子结构体系对局部mRNA包装来抑制其被调控机制接触,具有重要意义。

研究团队设计了一种针对m6A甲基化的大规模并行检测试验(Massively Parallel Assay for m6A, MPm6A)来试图回答这样一个直观的问题:如果我们通过质粒表达细胞内生的m6A位点附近的序列,这些位点是否还会被甲基化?作者利用MPm6A系统性地研究整个表观转录组中m6A甲基化的选择因素。如果m6A的分布主要决定于特定因子对甲基转移酶的招募,在报告基因的人工背景中应当看到许多细胞内源的m6A甲基化位点会丢失甲基化。然而,与预期相反,研究人员发现了对靶向转录本m6A甲基化选择性抑制的新机制。在MPm6A试验里,数千个未甲基化(细胞内源的)的位点中,将近90%的位点在报告基因质粒表达中获得了甲基化——这是一个“大发现”的时刻——作者意识到应当跳出思维定式,去关注是什么抑制了,而不是什么促进了这些局部区域的甲基化。

图1. 外显子拼接复合体作为m6A“抑制器”调控m6A甲基化的转录组选择性

深入的机制研究表明mRNA剪接对于m6A甲基化的抑制非常重要,具有平均长度(~100 nt-200 nt)的内部外显子的剪接会抑制临近m6A甲基化,而异常长的内部外显子或终端外显子(terminal exon)的剪接则不会。是什么机制导致了这种依赖剪接和外显子长度调控的m6A甲基化抑制呢?研究人员发现EJCs抑制外显子结附近的m6A甲基化;在转录组上,数千至上万的m6A位点受结合的EJCs的抑制,造成了m6A特殊的全局分布,包括富集于长外显子和在终止密码子附近的富集急剧增加(在最后一个外显子-外显子结之后)。与此一致的是, 代谢标记和高校液相色谱-质谱联用实验表明,和领域内以往对剪接和m6A甲基化发生顺序的认知不同【13】,大量的m6A甲基化发生在剪接过程中或剪接完成之后。EJCs枯竭导致mRNA的普遍m6A超甲基化(hypermethylation),进而招募更多的m6A“阅读器”YTHDF2 【14, 15】,从而造成m6A介导、YTHDF2依赖的转录本不稳定, 因此,EJCs保护近端RNA免于m6A异常甲基化对于维持正常的基因表达至关重要。

进一步的功能研究表明,在人类和小鼠组织中,EJCs高表达与整体mRNA的m6A甲基化以及高丰度相对应,说明EJCs在这些组织中通过抑制m6A甲基化调节mRNA稳定性。此外,这种外显子-内显子的体系结构对于影响m6A甲基化的分布和通过m6A介导、依赖YTHDF2的mRNA稳定性调控在脊椎动物中普遍纯在。

这项工作鉴定了EJCs作为m6A“抑制器”调控m6A甲基化全局分布,EJCs通过抑制m6A甲基化影响从而影响转录本的稳定性。此外,EJCs介导的mRNA包装不仅影响m6A甲基转移酶对于外显子结近端mRNA的可及性,这项工作初步表明EJCs对mRNA的包装功能也普遍抑制其他mRNA调控机制对局部mRNA的可及性,从而对基因表达调控产生更广泛的影响。

芝加哥大学Dr. P. Cody He (何宇超博士)、魏江博博士、豆晓阳博士和Dr. Bryan T. Harada为本文的共同第一作者。芝加哥大学何川教授为本文通讯作者。芝加哥大学陈梦洁教授也参与了这一工作。该工作得到实验室其他成员和合作团队的大力支持。

作者延伸解读:

总的来说,RNA甲基化对于各种生物过程和多种人类疾病都有重大影响,在过去十多年中这一领域得到了长足发展。从2010年来自我们实验室对于RNA表观遗传学的评述展望起【16】,这个领域从2011年只有一篇关于FTO对于mRNA m6A去甲基化的文章 【17】,到现在每年有数千篇相关的文章。与此同时,大量的RNA甲基化研究开始进入小分子疾病治疗、干细胞治疗和农业相关的应用。

然而, 在这项工作之前,没有人知道形成全局m6A甲基化景观的决定性因素是什么。m6A甲基化具有非常独特的分布(富集于长外显子和终止密码子附近),但我们不理解其原因和机制。我们花了五年时间来研究这个核心问题:细胞是如何选择在哪些mRNA上的哪些位点进行甲基化的?我们发现m6A甲基化全局景观并不是由主动招募甲基转移酶来建立的,而是主要由于特定蛋白作为“抑制器”来限制甲基转移酶对其底物的可及性决定的。这一发现具有重大意义:1)解释了m6A甲基化的全局选择性是如何实现的;2)这一抑制机制表明mRNA包装以限制RNA可及性的方式调控其甲基化和其它蛋白结合,代表了基因表达调控的一个全新机制;3)我们的分析也表明在人类和小鼠组织里,以及脊椎动物的进化过程中,这是一种新的调节mRNA稳定性的机制;4)在实验室应用和基因治疗上,这一发现表明,由于缺少内源性外显子架构和适当的EJCs组装,报告基因构建体和cDNA表达构建体在体内可能会被过度甲基化而改变稳定性。这一机制为未来基因疗法的设计提供了新的重要参考。

专家点评

付向东(UCSD)

m6A是最广泛的mRNA修饰。在早期的测序研究中,m6A主要在3‘UTR被检测到。METTL3/METTL14甲基转移酶复合体特异性催化组装m6A的DRACH序列在转录本/转录组上是相对平均分布的,但核心问题是什么机制导致了mRNA一些特定的区域上缺少m6A甲基化。何川团队的最新研究揭示了pre-mRNA剪接中结合mRNA序列的外显子拼接复合体(EJC)抑制了内外显子的m6A修饰。

这一发现的重要性不只限于m6A修饰的研究领域,因m6A修饰和多项表观遗传事件如组蛋白修饰、pre-mRNA剪接、多聚腺苷化、RNA输出以及RNA稳定性相关联,这一成果的影响将非常深远。多个证据表明m6A修饰伴随转录生成,通过m6A阅读器和RNA代谢紧密协同耦合。除一些调控功能的外显子之外,内含子移除和EJC进行的外显子拼接伴随转录进行,何团队的新成果说明m6A修饰在剪接之后发生。m6A修饰在转录后发生,因此可以和其它重要的RNA代谢过程相互作用,相关重要的协同过程需要在今后的研究中被重新探索。

m6A is the most prevalent modification in mRNAs. Early mapping studies have shows that m6A is predominantly detected in 3’UTRs. The question is how other mRNA regions are devoid of such modification despite the relatively equal frequency of the DRACH motifs for METT3/14 to act on. The current study from He lab revealed that the internal exons are largely suppressed by the exon junction complex (EJC), which is deposited during pre-mRNA splicing.

This finding is significant beyond the specificity issue in m6A modification because m6A has been linked to multiple epigenetic events in the genome, such as histone modification, pre-mRNA splicing and polyadenylation, RNA export, and stability control. Various evidence suggests that m6A addition takes place during transcription, which via its specific readers mediates coupling with other RNA metabolism pathways. Because intron removal and EJC deposition are known to take place co-transcriptionally, with the exception of various regulated exons, the new study then argues that m6A must be added after splicing in most cases. Such post transcriptional events would allow functional interplays of m6A with other RNA metabolism pathways, but the heretical order of various coupling events may need to be revisited in future studies.

专家点评

杨运桂(中国科学院北京基因组所,研究员)

N6-甲基腺嘌呤 (N6-methyladenosine, m6A) 是高等生物mRNA中含量最丰富的甲基化修饰,参与调控诸多重要生物学过程。m6A修饰的动态性除了受到甲基转移酶METTL3/METTL14复合物和去甲基化酶ALKBH5/FTO调控,还被RNA聚合酶II的转录状态、组蛋白修饰及非编码RNA等调控。而m6A修饰在mRNA上特异的分布特征的机制仍然有待研究。

芝加哥大学的何川教授团队在本研究中,开发了大规模平行报告实验体系(MPm6A),把内源检测无修饰的DRACH序列克隆到报告系统中,其中90.2%可以被检测到m6A修饰,这些序列认定为被抑制的m6A位点。而这些被抑制的位点在mRNA上的分布有别于内源水平可以被检测到的在非终止密码子附近富集的m6A,主要富集于编码区(CDS)和3’ UTR,倾向于修饰短的内外显子(internal exon)。进一步分析发现,pre-mRNA的剪接外显子拼接复合体(Exon-junction complex)的组装能抑制剪接位点附近的m6A修饰的形成;敲低EJC的核心组分EIF4A3 和/或RBM8 A导致在短外显子上大量高修饰位点形成,一方面改变了m6A在mRNA上的固有分布特征,另一方面导致了大部分mRNA的稳定性下调。EJC抑制m6A的形成及mRNA的稳定性的机制在不同的组织器官和物种中均具有保守性。

这一新发现拓展了对m6A修饰研究维度,揭示了m6A在mRNA上呈现特殊分布特征的内在调控机制,确认了m6A修饰与mRNA的剪接和稳定性关联。

专家点评

陈玲玲(中国科学院分子细胞科学卓越创新中心,研究员)

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)是最广泛存在于mRNA上的碱基修饰,在多种生物学过程中发挥重要作用。探究m6A修饰特异性调控机制对理解m6A生物学功能具有重要意义。来自何川团队发表在Science上的最新成果发现了首个m6A选择性修饰调控机制:pre-mRNA剪接特异性抑制了中等长度外显子靠近剪接位点区域的m6A修饰,而长外显子或位于基因末端的外显子上m6A修饰则不受影响。具体而言,外显子拼接复合体(Exon-Junction-Complex,EJC)结合pre-mRNA阻止m6A修饰发生,而长外显子无EJC复合体覆盖区域较长,因此其上m6A影响不大,实现m6A在这些外显子上靠近剪接位点区域的选择性修饰。敲除EJC复合体的组分(EIF4A3)导致转录组水平m6A升高、促进mRNA降解,提示内源m6A修饰水平需要被EJC严格控制的重要生理功能;此外,mRNA甲基化修饰在组织和种属间的差异调控也与EIF4A3表达呈现负相关。值得一提的是,作者发展了MPm6A(大规模并行检测技术),通过并行检测无内含子质粒载体的m6A修饰情况并与内源m6A修饰位点进行比对,发现其与内源m6A修饰位点存在诸多不同之处。这一发现成为了起始这项重要研究工作的关键点之一。这不仅提示了以往研究常用的无内含子的表达质粒可能造成m6A 超甲基化的情况,其精妙之处更在于何川团队从独特视角开始探索一个长期未被回答的关键科学问题,即m6A修饰的特异性是如何实现的。

何川团队这项发现非常重要,是在之前已知的m6A修饰一系列效应蛋白如 “writers” “readers” “erasers”之上,首次揭示EJC复合体是m6A的“suppressors(抑制器)” 。该发现很好的解释了一些已知的实验现象,比如,LINE-1元件总的来说没有剪接事件发生,因此没有EJC复合体覆盖,从而可见高水平的m6A修饰。更重要的是,该研究报道的EJC复合物抑制m6A修饰也将m6A修饰动态调控无缝整合进了 mRNA的生产加工代谢过程中,并且给今后的探索工作提供了多种潜在思路。例如,EJC复合体调控m6A修饰的具体分子机制是怎样的?m6A修饰或mRNA剪接在某些特异性位点发生的先后顺序如何?pre-mRNA折叠与结构是否参与调控EJC抑制m6A修饰的效率?基于EJC复合体调控新生mRNA的重要作用,EJC复合体抑制m6A修饰这一重要发现为mRNA成熟和质控的动态过程赋予了一个全新层次的调控。此外,该发现也提示多层次mRNP组装可能在一定程度上类似于组蛋白对DNA组装形成特定染色质结构,从而在进化中更增加了转录和转录后基因表达调控的复杂性和多样性。

原文链接:

http://doi.org/10.1126/science.abj9090

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