癌症免疫治疗彻底改变了肿瘤学的面貌。然而，患者对相同的免疫疗法的反应往往不同。特别是，许多癌症类型对检查点阻断治疗的反应率仍然很低（黑色素瘤、肾细胞癌和结肠直肠癌的反应率为20-40%）。肿瘤滤过性白细胞（TIL）与癌症进展和癌症患者的临床终点密切相关。特别是，临床数据表明，M1巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）水平高与预后良好有关，而中性粒细胞-淋巴细胞比率升高则预示着癌症患者的生存率较差。为了评估肿瘤免疫微环境（TIME）中的TIL，以便在癌症免疫治疗之前和期间对患者进行分层并预测结果，已使用流式细胞术、组织学染色和活检肿瘤组织的质量细胞术。然而，活组织检查是侵入性的和静态的，可以导致转移，并且只能揭示时间的区域信息；外周血分析不可避免地包含从肿瘤以外的组织分泌的生物标志物，限制了其对时间的特异性。

分子成像为整个时间的纵向监测提供了一种实时和非侵入性的技术。然而，包括计算机断层扫描、正电子发射断层扫描和磁共振成像在内的现有成像模式无法准确监测TIME中的TIL，因为它们依赖抗体或配体偶联的造影剂来靶向感兴趣的白细胞，并且它们的“常亮”信号不可避免地会因肿瘤以外组织中的非特异性滞留而加剧。相反，可激活分子光学探针仅在存在预期生物标志物的情况下提供信号，从而使背景噪声最小化，并且可以提供随生物标志物浓度和活性而定的定量信号。最近，可激活分子探针（AMPs）已被开发用于白细胞的实时成像；然而，由于它们的激活机制仅由淋巴细胞生物标志物决定，它们的信号可以由外周血或炎症组织中的白细胞非特异性触发。TIL的特定实时非侵入性成像仍然是一个挑战。

鉴于此，南洋理工大学浦侃裔等人展示了串联激活分子探针（TAMP）允许TIL的近红外荧光（NIRF）实时成像，用于伴随诊断和预测癌症免疫治疗的结果。

TAMP包括三个关键单元：肿瘤被动靶向部分、荧光信号部分和双重锁定的TIL响应部分，这些部分只有在肿瘤和白细胞生物标志物存在的情况下才能完全裂解。TAMP本质上是非荧光的，只有在肿瘤和淋巴细胞生物标志物存在的情况下才能激活其NIRF信号。这种“双重锁定”串联设计确保信号激活仅由正常组织和其他炎症组织中的TIL触发，而不是由白细胞触发。

图|用于TIL的特定分子光学成像的TAMP的设计和机制

研究人员合成了TAMPM1、TAMPCTL和TAMPNE，分别检测M1巨噬细胞、CTL和中性粒细胞，用于时间的实时动态成像。为了排除肿瘤中TAMP的积累差异，研究人员使用聚乙烯吡咯烷酮IRDye 800（PVP-IR800）作为“常开”参考探针。此外，由于TAMP的高肾清除率，该探针可用于TIME的荧光尿液分析。

探针的荧光仅在存在肿瘤和白细胞生物标志物的情况下才被激活，这允许对癌症小鼠模型中的特异性TIL群体进行成像，其敏感性和特异性类似于通过对活检肿瘤组织的流式细胞术分析所实现的敏感性和特异性。

图|TAMP与单锁定AMP相比的优越性

这一系列的TAMP能够实时分析TIL，为准确绘制肿瘤内免疫环境提供了一种非侵入性的方法。此外，TAMPs对TILs具有高度的特异性和敏感性，在肿瘤切片的免疫荧光染色中显示与它们各自的TILs重叠超过70%，并且它们的R-NIRFs（R ≥0.73 0.74, ρ ≥ 0.85）用流式细胞术测定TIL水平。TAMP的这种实时分析能力也在包括巨噬细胞和嗜中性粒细胞靶向治疗在内的其他治疗中得到验证。因此，TAMP使能够准确区分免疫原性差（4T1）和高免疫原性（CT26）肿瘤，并密切监测CTL的浸润，巨噬细胞的极化和中性粒细胞的变化，以及不同疗法的结果。

TAMP的高肾清除效率和荧光开启反应为TIL的荧光尿液分析提供了一种方便的方法。与实时成像数据一致，排泄的TAMP的尿液R-NIRF准确地反映了其各自的TIL群体（R ≥ 0.75, ρ ≥ 0.87）。基于TAMP的尿液分析使能够高精度地区分未治疗的CT26肿瘤和未治疗的4T1肿瘤，以及aPD-L1治疗的CT26肿瘤和aPD-L1处理的4T1瘤。此外，在癌症免疫治疗早期，TAMPs的尿R-NIRFs预测了终点的相对肿瘤体积，其中TAMPM1和TAMPCTL呈负相关（R ≥ 0.74, |ρ| ≥ 0.86），并且TAMPNE与相对肿瘤体积呈正相关（R ≥ 0.89, ρ ≥ 0.94)。

图|CT26荷瘤小鼠TIL的体内实时NIRF成像

除了尿液分析外，TAMP还通过显微镜检查描绘了TIL在整个肿瘤切片中的空间分布。TAMP染色显示了治疗后TIL的位置和密度的变化，显示分布在肿瘤中心的阳性预后TIL（M1巨噬细胞和CTL）较多，阴性预后TIL较少（中性粒细胞），M1巨噬细胞水平高1.5至2.0倍，CTL水平比未经治疗的肿瘤高1.6至1.9倍，中性粒细胞水平比未治疗的肿瘤低3.1至4.5倍。

图|TAMPs预测癌症免疫治疗

总而言之，该研究开发了一套TIL特异性分子荧光探针（TAMP），用于癌症免疫治疗的伴随诊断和预后。TAMP具有独特的双重锁定传感机制，允许与TIL进行特异性荧光相关性。基于TAMP的实时成像和尿液分析是非侵入性和动态的，可用于在侵入性活组织检查的静态流式细胞术分析水平上分析具有敏感性和特异性的多种TIL。TAMP的信号相关性允许对肿瘤免疫原性进行准确分析，并允许对时间变化进行纵向监测。因此，TAMP代表了一种高通量、非侵入性和有效的方法，可以在临床前环境中筛选联合免疫治疗剂，并在个性化联合癌症免疫治疗的患者分层、免疫治疗干预的优化和免疫治疗结果的预测方面具有转化潜力。TAMP的模块化双锁定串联设计可以推广用于在靶向疾病位点特异性检测来自靶向细胞的生物标志物。

参考文献：

He, S., Cheng, P. & Pu, K. Activatable near-infrared probes for the detection of specific populations of tumour-infiltrating leukocytes in vivo and in urine. Nat. Biomed. Eng (2023).

https://doi.org/10.1038/s41551-023-01009-1

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