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在细胞中，天然的马达蛋白，例如肌动蛋白、动力蛋白和肌球蛋白，主要沿着微管和肌动蛋白轨道进行移动。得益于成熟的DNA折纸技术或化学合成手段，实验室构建的可动分子（mobile molecules）的运行轨道主要由DNA双链或化学合成的长链分子所组成。蛋白分子因为其3D结构的复杂性，一直未能被用于搭建可供化学分子移动的轨道。
牛津大学Yujia Qing课题组利用β-多肽链的平面结构构建了一条小分子运行轨道
（图1A）。该轨道位于α-溶血素（αHL）孔内，由相隔约6.9 Å的一系列半胱氨酸组成。半胱氨酸是蛋白轨道的理想构建块，因为它的侧链巯基在去质子化后是一个强大的亲核试剂，可以参与各种快速且通常是可逆的化学反应（例如巯基-二硫键交换和砷(III)-巯基化学反应），使得分子能够在以秒计的速度下进行移动。利用电流检测手段，该分子移动可被实时观测。
在最新的工作中，通过与Hagan Bayley课题组和Fernanda Duarte课题组的合作，巯基多肽分子轨道的反应活性被进一步评估，通过工程化改造周围的蛋白环境，
更快的分子移动成为可能。文章近期在Angew. Chem., Int. Ed.近期上线，第一作者为薄宗婳与Zhong Hui Lim。
图1：化学可动分子可以在蛋白轨道上移动。
作者们首先在单分子水平上以硫醇-二硫键交换反应作为模型反应测量了每一个半胱氨酸的反应活性，通过pKa值以及完全质子化时的反应速率作为定量表征。具体来说，作者在113、115、117、119、121或123位点进行单个半胱氨酸突变（图2A）。利用磷脂膜对二硫化物与硫醇进行空间分离，通过三步连续硫醇-二硫键交换反应构成一个循环，进行重复循环的单分子反应速率采集
（图2B）。在硫醇-二硫键交换反应中，化学反应性由半胱氨酸巯基的pKa值和相应巯基阴离子的亲核攻击的反应速率常数决定。作者通过监测通过纳米孔的离子电流的变化追踪反应中的断键和成键事件，并计算了每个半胱氨酸巯基的pKa值和反应速率常数。作者发现，在一个近乎平面的蛋白环境中，成轨道的半胱氨酸被发现pKa值
在9.17到9.85之间，存在约0.6个单位的差别，模型反应速率可相差近20倍。这反映了半胱氨酸巯基活性对周围环境的敏感性，符合它作为生物体内常见的活性基团在不同蛋白结构内呈现出来的巨大活性差别。
图2：单分子活性表征。
在之前野生型蛋白架构下，113位点上的半胱氨酸的反应速率最低。作者尝试通过蛋白工程调节轨道内半胱氨酸的反应活性。作者设计了E111S和E111Q两个突变，并测试了113位点上的半胱氨酸的反应速率。作者发现两种突变都导致113位点上的巯基的模型反应速率的提升：E111S导致反应速率增加了3.5倍，E111Q 导致反应速率增加了5.5倍（图3b）。E111Q导致的更大速率增强意味着较长的侧链能够为巯基-二硫键交换提供更有利的相互作用。
图3：蛋白工程提升巯基轨道活性。
通过PyMOL建模，作者确定了突变环境中的有利氢键和离子交互作用，这些相互作用预测可以降低113和115位点上的巯基的pKa值，促进亲核巯基负离子的形成，并改善半胱氨酸巯基的离去基能力。
随后，作者将E111Q突变引入到含有五个半胱氨酸的蛋白轨道中，并于野生型蛋白轨道进行了比较。作者发现，在+150 mV的电压下 E111Q突变提升了113到 115的移动速度，但是在-150
mV的电压下115到113的移动速度仍然较慢（图4d）。作者将速率提高的变化归因于在相反电势下DNA构象的不同。在+150 mV的电压下，DNA与113位点上的巯基结合并朝向蛋白纳米孔道的跨开口，大约有4个磷酸二酯基团处于电场内。在113位点上的二硫键与115位点上巯基对其，形成硫醇-二硫键交换反应所需的共线构象。相比之下，在-150 mV的外部电压下，DNA与115位点上的巯基结合并朝向孔道的顺开口，仅有约1个磷酸二酯基团处于电场内。DNA具有更多的自由度，减少了所需的巯基-二硫键交换的线性构象的出现。作者随后将反应溶液的pH值的由8.5升至9.5，这将分子移动的反应速率增加了5至8倍。
总体来说，E111Q突变将分子运动的总体时长从59秒 缩短到了40 秒。配合反应溶液的pH值的提升，分子运动的总体时长从59秒降低到14秒。（图4d）。
图4：蛋白工程加速分子移动速率。
该工作中，Yujia Qing团队通过系统的化学反应活性分析、蛋白工程改造、以及分子动力学模拟，揭示了多肽轨道组成基团的化学活性对周围的氨基酸侧链敏感的特性。轻微的蛋白环境改变（比如单个点突变），尽管只有极小的能量改变，就可以使化学反应以及分子移动的速度成倍增加。
论文信息
Mobile Molecules: Reactivity Profiling Guides Faster Movement on a Cysteine Track
Angewandte
Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202300890
作者简介
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Yujia Qing教授于2012年获得谢菲尔德大学的化学学士学位，后来前往牛津大学完成了药理学硕士学位。2014年，她加入了Hagan Bayley教授的研究组攻读完成了化学生物学的博士学位，并于毕业后继续从事博士后研究。2019年，Yujia Qing获得了Reaxys博士研究生奖和Dream Chemistry奖。2020年，Yujia Qing成为Glasstone学者。2022年，Yujia Qing被任命为牛津大学化学系副教授，研究方向是利用工程化的蛋白纳米孔作为纳米反应器，实时监测单个键合和断裂事件，探索单分子水平的化学反应。同时，Yujia Qing教授还致力于通过工程化蛋白质纳米反应器实现矢量催化。
原文链接
https://doi.org/10.1002/anie.202300890
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