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今天推送的文章是2022年5月发表在ACS Catalysis上的“Engineering P450 Monooxygenases for Highly Regioselective and Active p-Hydroxylation of m-Alkylphenols”，通讯作者是来自新加坡国立大学化学与生物分子工程系的李志教授。

苯酚等芳香族化合物的区域选择性羟基化可以产生用于合成许多有价值的生物活性化合物，但通常缺乏有效的催化剂。间烷基酚的羟基化反应也存在较低的区域选择性或低活性的问题。本文旨在开发具高选择性及高活性的新酶，使间烷基酚1a-e经对羟基化合成间烷基苯-1,4-二醇2a-e (方案1)。到目前为止，还没有关于间烷基酚1a-e羟基化的酶的报道。P450BM3单加氧酶的催化具有更广泛的底物范围的羟基化，包括脂肪酸，烷烃，药物和邻取代苯，作者选择该酶来工程化以开发间烷基酚靶向对羟基化的生物催化剂。

间烷基酚1a-e 与 P450BM3单加氧酶的对羟基化反应

首次用P450BM3单加氧酶研究了间烷基酚1a-e的羟基化反应。1a-e 与共表达P450BM3单加氧酶和葡萄糖脱氢酶(GDH)的大肠杆菌(8 g cdw/L)反应2h后，NAD(P)H的羟基化转化率分别为5.1%、7.8%、9.9%、49%和25%。1a-b羟基化产物(4-OH/6-OH)的比例分别为96:4和92:8, 1c-e羟基化产物的比例分别为76:4，0:100和61:39。显然，对于间烷基酚1a-e的对羟基化，p450BM3单加氧酶的活性和区域选择性均较低，因此亟需改善。

烷基酚1a-e 对羟基化 P450BM3单加氧酶突变体的设计

重塑 p450BM3的活性口袋和底物通道可能会提高间烷基酚1a-e的对羟基化的活性和区域选择性。因此，基于间烷基酚1a与P450BM3单加氧酶的X射线结构的分子对接，选择了这些区域中的8个关键氨基酸残基（图1）。

F87，A328和I401位于核心口袋中。设计突变F87V和A328F以通过在87处引入较小的疏水性残基缬氨酸和在328位引入大体积和疏水性的苯丙氨酸来使底物结合更接近血红素以进行对羟基化。I401位于血红素环下方，因此设计突变I401W和I401P，分别通过引入色氨酸和脯氨酸使血红素更接近底物。

A82和L181位于底物通路和结合的中间途径(图1)。这些位点的突变可以改变底物通路中途的形状和极性，从而影响催化作用。设计突变体A82F，以侧链庞大的苯丙氨酸代替丙氨酸，增强疏水性的同时增强空间位阻。高疏水性可以促进疏水间烷基酚与底物的结合，而空间位阻的增加可以促使底物更接近血红素进行催化。与苯丙氨酸相比，色氨酸表现出较大的空间位阻，但疏水性较差，因此没有被选择。对于L181，引入极性氨基酸来影响间烷基酚底物OH的取向。由于谷氨酰胺具有与亮氨酸相似的侧链形状，但极性较高，因此被选为目标突变体。

R47，Y51和 L188位于底物接触通道中。引入突变体R47I和R47L可以增加疏水性，扩大疏水性较强的间烷基酚1a-1e的通道。用侧链较小、具有特殊结构的P代替L来重塑L188P区域，为底物进入提供更大的空间。Y51F和 Y51W的设计同样以增加疏水性为目的，同时保持相似的氨基酸大小。

将来自结合口袋(F87V，A328F，I401W，I401P)，中间通路(A82F和L181Q)和入口通道(R47I，R47L，L188P，Y51F和Y51W)的突变组合以设计用于羟基化的多个突变体。初步检测表明，F87V和A328F对间甲基酚1a的羟基化活性显著增强，因此，多个突变体主要是在F87V和A328F分别与其他突变体组合的基础上产生的。总共设计了18个突变体，分别用于间烷基酚1a-e的羟基化反应。

增强间烷基酚1a-e区域选择性和对羟基化活性的P450BM3突变体工程

设计的P450BM3突变体在大肠杆菌中与NAD(P)H激活酶GDH共表达。用细胞检测间烷基酚1a-e的对羟基化反应。根据表1所示结果，分别选择R47I/A82F/A328F, A82F/A328F和F87V/L188P/I401P/R47L/Y51F,F87V/R47I/Y51F,F87V/L188P/I401P/R47L/Y51F/L181Q,F87V/L188P/R47I分别被选择用于间甲基苯酚1a-e的p-羟基化的进一步研究。

观察到的多个突变体对1a-e羟基化的活性和区域选择性是改变催化口袋、底物通道中途和底物入口通道的整体效应。突变体A328F催化的1a-e羟基化转化率分别为60%，49%，38%，19%和9%，随着1a-e烷基链长度的增加而减少，这可能是由于小的丙氨酸变成了大的苯基丙氨酸，导致底物的结合口袋明显变小，从而使其更难与长烷基链的底物结合。然而，突变体F87V增加了催化口袋的空间，从而使1a-e除1b外的羟基化转化率高于野生型酶。突变I401W改变了血红素环的取向，从而改变了催化性能。

P450BM3突变体催化间烷基酚1a-e 对羟基化的分子对接及模拟

通过分子对接获得了对P450BM3突变体增强区域选择性和活性的基于结构的理解（图 2）。在1a与酶的结合态中，野生型P450BM3的血红素氧原子（heme-O）与间烷基酚1a的C4（对位）和C6（邻位）之间的距离为4.6和3.5 Å（图2 A1），而突变体 A82F/A328F/R47I 的相应距离为3.5和5.8Å（图2 A2)，导致p-区域选择性和活性增强。三点突变中的A328F突变位点可能有助于使底物1a更接近血红素-O，从而有助于提高活性和区域选择性。单突变体A328F也表现出增强的活性和区域选择性，这可能是由类似的效果引起的。引入突变A82F以形成双突变体A82F/A328F进一步提高了区域选择性，但活性降低，这可能是因为底物结合位点的牢固程度更高，底物结合口袋尺寸减小。引入突变R47I扩大了底物通道，从而显著提高了活性。

底物1b在突变体F87V/L188P/I401P/R47L/Y51F中的对接揭示了血红素-O与间乙基苯酚1b的C4和C6之间的距离为3.6和4.7Å（图2 B1）。相比之下，野生型P450BM3中的相应距离为6.4和4.8Å（图2 B2）。因此，突变体的结构变化使底物在催化口袋中采用更好的构象进行对羟基化，从而增强了区域选择性和活性。

对于底物1c的p-羟基化，突变体F87V/R47I/Y51F 显示血红素-O和1c的C4-碳之间的距离比野生型更短（3.2 Å vs 5.2 Å），而血红素-O和1c的C6之间的距离更长(5.4 Å vs 3.7 Å) (图2 C1,C2)。这可以解释突变体对p-羟基化的活性增强和区域选择性的改善。虽然突变F87V可以扩大结合口袋，但突变R47I/Y51F可以改善底物的可及性，进而导致其增强的活性（94% 转化率和89%的p-区域选择性）。

将底物1d与野生型P450BM3分子对接，突变体F87V/L188P/I401P/R47L/Y51F/L181Q使突变体1d的血红素-O与C4的距离比野生型短(3.2 Å vs 4.4 Å)，这显示出增加的活性，1d的血红素-O与C6的距离比野生型长(5.4 Å vs 3.7 Å)，以实现高的p-区域选择性(图2 D1,D2)。

突变体F87V/L188P/R47I的血红素-O距底物1e C4的距离比野生型短(3.7 Å vs 4.3 Å)，距底物1e C6的距离比野生型长(5.0 Å vs 3.6 Å) (图2E1,E2)。因此，该突变体对底物1e的对羟基化表现出优异的区域选择性和增强的活性。

突变体R47I/A82F/A328F和野生型P450BM3对间甲基苯酚1a对羟基化的分子动力学模拟

选择突变体R47I/A82F/A328F作为分子动力学模拟的典型例子，并与野生型P450BM3进行比较，以获得对间甲基苯酚 1a 对羟基化的区域选择性和活性的基于结构的理解。B因子显示突变体在三个区域具有增强的柔性：底物进入区域（R47I）、底物通道路径(A82F)和底物结合口袋(A328F)。同时，突变体-底物复合物表现出比P450BM3-底物更低的结合自由能（-13.1 vs -12.4 kcal/mol），这与测量的K_d值（13.7 ± 1.3 vs 152.2 ± 24.2 μM）一致。此外，间甲基苯酚1a的 C4 碳与血红素铁之间的距离分布使突变体的大部分构象落在4-8 Å范围内。这可能解释了突变体的对羟基化活性增强的原因。另一方面，1a的C6与血红素-铁之间的距离分布表明，突变体几乎所有构象的距离都超过了8 Å，而野生型P450BM3仍有部分构象的距离分布落在3-8 Å之间。因此，该三点突变体几乎没有邻羟基化，而是具有出色的对羟基化区域选择性。

本文研究了一组P450BM3单加氧酶突变体，作为间烷基苯酚1a-e对羟基化反应的第一个具有区域选择性和活性的生物催化剂。R47L/Y51F/F87V/L188P/I401P,R47I/Y51F/F87V,R47L/Y51F/F87V/L181Q/L188P/I401P,R47I/F87V/L188P催化间烷基酚1a-e的对羟基化反应，得到相应有价值的间烷基苯-1,4-二醇2a-e，其区域选择性转化率分别为91-99% 和95-99%。通过基于建模的突变设计来重塑底物结合口袋和通路。所得P450BM3突变体对间烷基酚1a-e的催化效率为234~381 mM^-1min^-1, 区域选择性和活性均显著高于野生型P450BM3。

分子对接和模拟显示，与野生型酶相比，P450BM3突变体的血红素-氧原子与底物C4之间的距离更短，与底物C6之间的距离更长，底物通道更大，从结构上理解了该突变体的区域选择性和活性。对突变体R47I/A82F/A328F和野生型P450BM3进行间甲基酚1a对羟基化的分子动力学模拟，进一步揭示了该突变体的催化作用和区域选择性，该突变体具有较低的结合自由能，且大多数MD构象能够实现p-羟基化，而没有o-羟基化的构象。本研究中获得的理解和手段可以用于其他羟基化反应的P450单加氧酶的工程，以达到所需的选择性、活性和底物可及程度。这为通过对羟基化从容易获得的底物合成有价值的化合物提供了一种绿色的方法，是其他催化剂体系无法实现的。

END

整理：董如月

DOI：10.1021/acscatal.1c06011