撰文 | 望夜
皮肤的表皮为机体内部环境提供首道物理防线。表皮包含多个表皮细胞层，由不同有丝分裂活性基底细胞分化而来，后者贴附在基底膜上。表皮分化过程涉及约3500种基因的表达变化【1】，已知其中超过85种基因的异常表达会导致疾病。但小分子在表皮分化中的作用及其对相关蛋白的调控作用尚未研究清楚。
葡萄糖是机体能量的主要来源，经过代谢产生ATP支持各种生命活动，如酶促合成、胞内运输、细胞增殖等。2022年11月28日，斯坦福大学Paul A. Khavari课题组在bioRxiv上刊发了文章Glucose modulates transcription factor dimerization to enable tissue differentiation，发现葡萄糖会在包括表皮在内的多种组织的分化细胞中积累这种积累并未引起代谢的增加，且非代谢型是葡萄糖类似物可以拯救葡萄糖剥夺的不利影响，暗示葡萄糖本身可以作为分化过程的分子信号。作者还发现葡萄糖可以直接结合分化转录因子IRF6【2】，增强分化基因的诱导。上述观察表明葡萄糖的直接结合可能重塑分化必需蛋白的功能。
上述发现促使该团队继续找寻新的葡萄糖结合蛋白。2023年1月5日，Paul A. Khavari课题组在Cell上发表了文章Glucose dissociates DDX21 dimers to regulate mRNA splicing and tissue differentiation，借助叠氮-葡萄糖点击化学，他们发现葡萄糖可结合多种RNA结合蛋白（RBP），包括DDX21 RNA解旋酶，后者是表皮分化必需的。葡萄糖结合DDX21的ATP结合结构域，改变蛋白构象，抑制其解旋酶活性，并解开DDX21二聚体。分化中的葡萄糖水平升高与DDX21从核仁到核质的重定位相关，DDX21在核质中组装进入包含剪接因子在内的大型蛋白复合体中。DDX21通过葡萄糖依赖的方式定位到mRNA内含子中特定的SCUGSDGC基序，并促进关键分化基因前体的剪接，包括GRHL3、KLF4、OVOL1、RBPJ。上述发现揭示出葡萄糖在调节组织分化相关的RNA解旋酶二聚化和功能中的作用机制。
DDX21是一种含有DEAD结构域的RNA解旋酶，可催化ATP解开规则结构的RNA、RNA双链的分离及RNA-蛋白复合体的重塑【3】。目前已知DDX21参与核糖体RNA加工、RNA聚合酶II介导的转录，并可影响基因表达调控和细胞分化，但DDX21在表皮分化中的作用尚未获报道。
作者首先通过亲和层析纯化葡萄糖结合蛋白，同时利用点击化学反应抓取天然细胞内可与叠氮葡萄糖结合的蛋白，经质谱分析获得目的蛋白。两种方法同时捕获到的蛋白共有91种，其中大部分为RNA结合蛋白（RBP），含量最丰富的正是DDX21。由于RNA解旋酶的结构十分保守，层析法中还富集到另外31种RNA解旋酶，说明解旋酶是一类新发现的葡萄糖结合蛋白。
接着作者通过敲除实验证实DDX21是表皮分化必需的。微量热涌动（MST）和荧光淬灭（FQ）实验证实葡萄糖可结合DDX21，亲和力在微摩尔级别；而前述葡萄糖类似物3-O-甲基-D-葡萄糖（3OMG）也可以相似的亲和力结合DDX21。ATP酶活性实验显示葡萄糖和ATP竞争结合DDX21。突变体结合实验提示DDX21结合葡萄糖需要其ATP结合结构域中的某些序列。分子对接和质谱数据分析确认葡萄糖结合DDX的ATP结合结构域。
作者发现葡萄糖结合到DDX21的ATP结合结构域会改变其蛋白构象。由于二聚化是DDX21发挥其解旋酶活性必需的，且依赖其疏水的LAAALA序列【4】。作者通过将该序列突变为RRRRRR或删除，获得DDX21单体。微量热涌动,免疫共沉淀和非变性胶实验显示葡萄糖可抑制DDX21的二聚化。活细胞中的临近连接实验（PLA）也显示，在细胞分化过程中胞内的葡萄糖浓度升高，DDX21二聚体出现得更少。DDX21主要定位于核仁中【5】，而免疫荧光显示DDX21单体主要存在于核质。DDX21单体定位的改变是否由葡萄糖引起呢？作者通过升高或降低胞内葡萄糖浓度的方式观察DDX21的定位变化，确认葡萄糖促使的DDX21单体化伴随着其从核仁到核质的重定位。作者随后检查DDX21在基因组中的定位，发现基因启动子更易结合DDX21；而此时DDX21与染色质的结合并不受葡萄糖的影响，因此葡萄糖并不影响DDX21与基因组的结合。
由于DDX21主要定位于核内，作者接下来探究葡萄糖和ATP对分化的影响。作者使用具有纳米级分辨率、可测定胞内元素和同位素组成的NanoSIMS系统检测同位素标记的葡萄糖和ATP，发现ATP主要在前体细胞核内，分化细胞中的ATP水平较低；而葡萄糖则正好相反，在未分化细胞中含量低，在分化细胞的核内和胞质中均有升高，这与此前观察到的分化细胞中葡萄糖比ATP更易结合DDX21相吻合，暗示DDX21在分化中的功能可能并不需要结合ATP。作者进一步在培养细胞和组织类器官中进行突变体拯救实验，证实ATP酶活性并不是DDX21启动的分化必需的，而是前体细胞维持增殖所必需的，分化需要的是葡萄糖结合。作者还通过基因编辑在DDX21基因中引入点突变，经类器官培养证实上述结论。
接下来，作者使用快速液相色谱（FPLC）检测重定位后DDX21的分子量，发现其存在于一系列蛋白-蛋白体系中。将洗脱样与葡萄糖孵育会使DDX21迁移至更大的蛋白复合体中，说明葡萄糖使得DDX21整合到大型蛋白复合体中。近端蛋白质组学分析三种细胞状态（未分化胶质细胞前体，低葡萄糖浓度；分化的角质细胞，低葡萄糖浓度；分化的角质细胞，高葡萄糖浓度）下DDX21的临近蛋白，鉴定出约300种蛋白。其中143种在三种条件下均出现，其余的在不同条件下存在差异，说明葡萄糖会改变DDX21的临近蛋白谱。对上述蛋白进行GO分析发现低葡萄糖条件下富集rRNA加工相关蛋白，而正常葡萄糖浓度下富集的是mRNA剪接相关蛋白。经过进一步分析，作者确认葡萄糖促进DDX21靠近mRNA加工相关蛋白。
于是作者继续分析葡萄糖对DDX21 RNA互作的影响。RNA交联后免疫沉淀（CLIP）显示葡萄糖水平并未整体影响DDX21结合RNA。CLIP还鉴定出一段特异的RNA基序SCUGSDGC是转录组中DDX21的结合位点，体外重组DDX21结合RNA的实验显示其比已知最强的DDX21结合基序的还高7倍，因此CLIP-seq检定出一个天然的DDX21结合基序。作者还发现葡萄糖的结合并不影响DDX21对不同基序的结合，说明葡萄糖并非整体控制DDX21与RNA结合。进一步分析CLIP-seq数据，发现在分化的表皮细胞中DDX21更倾向于结合RNA的内含子区。同时数据支持一个模型，即葡萄糖可能在DDX21加工前体mRNA中序列特异性因子的角色。
最后，作者分析DDX21在葡萄糖调控的mRNA剪接中的作用。作者首先发现葡萄糖可能促使DDX21结合到某些特定的mRNA内含子以促使其剪接。其次发现，DDX21调节分化过程中的RNA剪接至少部分是通过直接结合葡萄糖来实现的。接着分析发现DDX21对分化特征基因ECM1剪接形式的调节是通过促进其外显子7的跳过（排除）实现的。此外，作者还确认DDX21在调节促进分化的mRNA剪接中的作用：对表皮分化和功能相关基因（如GRHL1-3、KLF4、OVOL1、RBPJ、JAG1、NOTCH3），DDX21会改变其分化相关外显子的使用或内含子的保留。
总之，本文揭示了葡萄糖在调节DDX21参与表皮分化调节中的重要分子指征作用。作者发现葡萄糖会直接结合DDX21的ATP结合结构域并促使DDX21二聚体解聚，促使DDX21单体离开核仁进入核质中，并整合入核内RNA处理复合体中。DDX21调节组织分化是ATP酶非依赖的，其可结合剪接因子从而调节关键分化基因前体的剪接。
值得注意的是，Cell杂志同时还发表了预览文章Sweet splicing对本研究进行推介评述。作者Maria Carmo-Fonseca指出，Miao等的工作挑战了人们对葡萄糖的固有认知并提出代谢物可作为蛋白功能调节器的可能性，同时推测葡萄糖很可能还参与多种细胞过程的调节，并可能影响基因表达的不同步骤，从转录到转录后RNA代谢。尽管仍有许多关键问题需要确认，本文提出的葡萄糖介导的蛋白功能调节也为理解葡萄糖水平紊乱导致的疾病（如糖尿病和肿瘤）提供一种新的思路。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.12.004
https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.11.025
参考文献
1. Kim, D.S., et al. (2021). The dynamic, combinatorial cis-regulatory lexicon of epidermal differentiation. Nat. Genet.53, 1564–1576.
2. Lopez-Pajares, V., et al. (2022). Glucose modulates transcription factor dimerization to enable tissue differentiation. BioRxiv, DOI: 10.1101/2022.11.28.518222.
3. Song, C., et al. (2017). SIRT7 and the DEAD-box helicase DDX21 cooperate to resolve genomic R loops and safeguard genome stability. Genes Dev. 31, 1370–1381.
4. Marcaida, M.J., et al. (2020). The human RNA helicase DDX21 presents a dimerization interface necessary for helicase activity.iScience 23, 101811.
5. Hirai, Y., et al. (2013). Nucleolar scaffold protein, WDR46, determines the granular compartmental localization of nucleolin and DDX21. Genes Cells18, 780–797.
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