肖御喆编译 医学营养MNT 2022-08-12 08:25 发表于江西

发布时间：2022 年 7 月 20 日

摘要发酵是一种传统技术，用于增加原料的类黄酮、维生素、矿物质等营养成分和风味。本研究采用短乳杆菌MJM60390 (FAB)发酵薏仁麸，并研究了抗黑色素生成作用。结果表明，FAB显著抑制小鼠黑色素原B16F10细胞中黑色素的积累，且活性高于非发酵薏米麸（NFAB）。分子机制研究表明，FAB通过抑制黑皮质素1受体（Mc1r）、黑素细胞诱导转录因子（Mitf）、酪氨酸酶（Tyr）、酪氨酸酶相关蛋白1（Trp-1）和酪氨酸酶相关蛋白 2 (Trp-2) 基因。Western印迹分析表明，与NFAB相比，FAB强烈降低了Tyr、Trp-1和Trp-2的表达。此外，以抗黑色素作用而闻名的酚类化合物，如没食子酸、对香豆酸、阿魏酸和芥子酸，与 NFAB 相比，FAB 显著增加。这些发现表明，FAB 作为抗黑色素生成剂具有巨大潜力，可用于美白化妆品的开发。关键词： 短乳杆菌MJM60390；薏苡仁；抗黑色素生成; 酚类化合物；酪氨酸酶

1、简介

黑色素是由表皮皮肤层中的黑色素细胞制造的色素。它还有助于改变肤色[ 1 ]。色素沉着保护皮肤免受紫外线 (UV) 辐射损伤和环境污染物[ 2 ]。然而，黑色素的过度积累或分布异常会影响健康和美丽，并导致色素沉着障碍，如白化病、雀斑、脂溢性角化病、太阳斑、炎症后色素沉着过度和黄褐斑[ 3,4,5 ]。

黑色素生成是黑色素合成过程，由酪氨酸酶的作用启动，酪氨酸酶控制 L-酪氨酸羟基化为 L-3,4-二羟基苯丙氨酸 (L-DOPA) 的速率，并将 L-DOPA 氧化为邻醌[ 6 ]。多巴醌继续转化为多巴色素。然后，多巴色素被酪氨酸酶相关蛋白2（Trp-2）或多巴色素互变异构酶转化为5,6-二羟基吲哚-2-羧酸（DHICA），最后，酪氨酸酶相关蛋白1（Trp-1）催化DHICA 形成真黑色素 [ 7 , 8 , 9 ]。紫外线、α-黑色素细胞刺激素 (α-MSH)、异丁基甲基黄嘌呤 (IBMX) 和毛喉素是影响黑色素生成的因素[ 10、11]。在 α-MSH 刺激过程中，α-MSH 首先附着在黑素细胞上的黑皮质素 1 受体 (Mc1r) 上，并在 Mc1r 下游启动信号传导。Mc1r 的下游信号传导涉及环磷酸腺苷 (cAMP) 和元件结合蛋白 (CREB) 的激活。先前的一项研究报道，cAMP 的参与和 Mitf 转录因子的激活上调酪氨酸酶、Trp-1 和 Trp-2 的表达，导致小眼相关转录因子 (Mitf) 的表达增加，从而导致黑色素细胞色素沉着增加 [ 6 ]。此外，过度的 UVB 照射会增加活性氧 (ROS) 的生成，从而刺激黑色素细胞合成更多的黑色素[ 12 ]。

薏苡仁在韩国传统上用于美白皮肤，据报道它可治疗炎症[ 13 ]、过敏[ 14 ]、微生物[ 15 ]和癌症[ 16 ]。薏仁种子包括四个部分：外壳、种皮、麸皮和胚乳。麸皮中含有丰富的酚酸和类黄酮（例如没食子酸、对香豆酸、阿魏酸、川楝素、柚皮素、橘皮素、芦丁和槲皮素）[ 17、18 ]，具有多种生物活性作用，例如抗高血脂[ 19 ]、抗癌[ 20 ]、抗炎和抗氧化活性[ 21、22]。薏苡仁在包括韩国在内的东亚地区广泛种植，薏仁麸是薏仁碾磨过程的副产品。据报道，薏米麸皮的植物化学成分含量高于去壳和抛光部分[ 23 ]。尽管含有丰富的活性成分，薏米麸几乎被用作牲畜饲料或堆肥。因此，利用薏苡糠开发化妆品是提高废料价值的好方法。

发酵已被用作保存、改善营养和口味以及延长原料使用时间的传统方法[ 24 , 25 ]。乳酸菌 (LAB) 是乳制品、葡萄酒、发酵蔬菜产品、肉类和食品工业中使用的主要微生物[ 26 , 27 ]。乳酸菌在发酵过程中对提高酚酸的生物活性和抗氧化活性也非常重要[ 28 , 29 ]。在之前的研究中，用鼠李糖乳杆菌发酵的米糠通过下调 Mitf 来减少黑色素生成[ 30] 并降低发酵后的细胞毒性[ 31 ]。据报道，通过超临界流体 CO 2提取的薏仁可减少黑色素生成[ 32 ]。然而，没有关于用乙醇提取的薏苡糠和 LAB 发酵的薏仁麸的抗黑色素生成作用的研究。因此，本研究调查了 LAB 发酵的薏米麸皮在 B16F10 细胞中的抗黑色素生成活性，并分析了薏仁麸皮提取物中的酚类化合物。

2 材料和方法

2.1 细胞培养

B16F10 小鼠黑色素细胞系购自美国典型培养物保藏中心 (Rockville, MD, USA)。对于实验，使用了 B16F10 细胞（从 5 到 10 代）。生长培养基是添加了 10% 胎牛血清 (FBS) 和青霉素 (10,000 U/mL) 和链霉素 (100 μg/mL) 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM; Hyclone; GE Healthcare Lifesciences, Logan, UT, USA) .将细胞在 37°C 和 5% CO 2的培养箱中培养。

2.2.薏仁提取物的制备

薏苡仁(Coix lachrymal-jobi ) 麸皮是从韩国生产薏苡仁的主要地方连川当地工厂获得的。薏米麸粉与水以20:80（w : w）的比例混合制成麸泥，121℃灭菌20分钟。

我们之前的研究[33]从发酵蔬菜中分离出短乳杆菌MJM60390 。对于种子培养，将 MJM60390 接种到 50 mL 的 De Man、Rogosa 和 Sharpe (MRS) 肉汤中，并在 37 °C 下厌氧培养 16 小时。然后，用 0.1% ( v / v ) 的短乳杆菌MJM60390种子培养物接种灭菌的薏仁麸污泥，并在 37°C 下静置培养 48 小时（FAB）。作为对照，使用未接种短乳杆菌MJM60390 (NFAB) 的薏米麸污泥在相同条件下培养。

接下来，用 70% 乙醇（1:3， v/ v）在室温下将薏仁麸（发酵或未发酵）提取24 小时。离心（6000 rpm 20 min）弃去固体部分，上清液用Whatman 1号滤纸过滤，蒸发，-80 ℃冻干24 h。将来自发酵 (FAB) 和未发酵 (NFAB) 薏仁麸的冻干提取物粉末保存在 -20°C 直至进一步实验。

2.3.细胞活力测定

为了确定薏仁提取物的细胞毒性，进行了(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 测定。B16F10 细胞在 96 孔板中以一定密度培养5 × 10 4细胞/孔在新鲜、完整的培养基中。在细胞中处理不同浓度（0.01-1000 μg/mL）的 NFAB 和 FAB 并孵育 72 小时。然后，将细胞用 5 mg/mL 的 MTT（Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO，USA）（100 μg/孔）再处理 4 小时。最后，去除上清液，加入 200 μL 二甲亚砜 (DMSO) 溶解 MTT 的代谢物甲臜晶体。通过酶标仪在 570 nm (TECAN Spectrofluor Plus, Maennedorf, Switzerland) 检测甲臜浓度。相对于未处理组确定细胞活力。

2.4.黑色素含量的测定

B16F10 细胞以 5 × 10 4接种在 6 孔板中细胞/mL 24 小时。24 小时后，用或不用 100 nM α-MSH 和薏仁麸提取物处理细胞并孵育 72 小时。熊果苷 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 用作阳性对照。处理结束时，收集培养液和细胞沉淀，测定细胞外和细胞内黑色素含量。对于细胞内黑色素，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤 3 次后，用含有 10% DMSO 的 1 N NaOH 收获细胞，然后在 60°C 下加热 2 h 以溶解黑色素。使用酶标仪在 405 nm 处测量黑色素含量。将总黑色素含量标准化为总蛋白质浓度。使用 BCA 试剂盒（Thermo Scientific，Rockford，IL，USA）测量蛋白质含量。

2.5.细胞内酪氨酸酶活性测定

B16F10 细胞（1 × 105 个细胞/孔）被铺在 6 孔板中并孵育 24 小时。然后，用或不用 100 nM α-MSH 和熊果苷或薏仁麸提取物以不同浓度（0.01-100 μg/mL）再处理细胞 72 小时。在处理结束时，将细胞用 PBS 洗涤 3 次，并在冰上用放射免疫沉淀测定 (RIPA) 缓冲液裂解 30 分钟。之后，将裂解的细胞离心（14,000 rpm，10 min），将 20 μL 上清液滴入 96 孔板中，用 200 μL 0.1% L-DOPA 处理，并在 37 °C 下孵育 30分钟。使用酶标仪在 475 nm 波长处测量酪氨酸酶活性，并将酪氨酸酶活性标准化为总蛋白浓度。

2.6.RNA 分离和 RT-qPCR

逆转录定量聚合酶链反应 (RT-qPCR) 分析用于分析 B16F10 细胞中的 mRNA 基因水平。首先，使用 Takara 试剂盒（TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，Takara Bio Inc.，Kusatsu，Shiga，Japan）从 B16F10 细胞中提取总 RNA。根据制造商的指南，使用另一个 Takara 试剂盒（PrimeScript™ RT Reagent Kit with gDNA Eraser，Takara Bio Inc.）从 1 μg 总 RNA 合成 cDNA。RT-qPCR 使用 cDNA、TB Green Premix Ex Taq (Takara Bio Inc.) 和黑皮质素 1 受体 (Mc1r)、黑素细胞诱导转录因子 (Mitf)、酪氨酸酶 (Tyr)、Trp-1 和Trp-2。在所有测定中，使用以下程序扩增 Mc1r、Mitf、Tyr、Trp-1 和 Trp-2 cDNA：94 °C 10 分钟；94°C 15 s、60°C 1 min 重复 45 次；最后，95 °C 10 s，65 °C 60 s，97 °C 1 s。RT-qPCR 引物显示在表 1。

2.7.蛋白质印迹分析

在存在或不存在薏仁麸提取物或熊果苷的情况下，将小鼠黑色素 B16F10 细胞与 100 nM α-MSH 一起培养 48 小时。用冷 PBS 洗涤细胞，并用含有 1% 蛋白酶抑制剂混合物的 RIPA 缓冲液在冰上裂解 30 分钟。将裂解物离心（14,000 rpm，10 分钟），收集上清液，并使用 Pierce™ BCA 蛋白检测试剂盒测量蛋白浓度。含有相同量蛋白质 (30 μg) 的样品进行 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 并转移到聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜上。在 4°C 下，用 Tris 缓冲盐水 (TBS) 中的 3% 牛血清白蛋白 (BSA) 封闭膜 1 小时，然后与 Tyr 特异性一抗孵育 (1:100, Santa Cruz, CA, USA)， Trp-1 (1:1000, Abcam, Fremont, CA,USA)、Trp-2 (1:2000, Abcam) 和 β-actin (1:1000, Abcam) 在 4 °C 下放置 16 小时。用含有 0.1% (v / v ) Tween-20 (TBS-T)，每 10 分钟与 TBS 一起使用一次，并与辣根过氧化物酶偶联的二抗 (1:10,000) 在室温下孵育 1 小时。然后，将膜用 TBS-T 洗涤两次，用 TBS 洗涤一次。使用化学发光试剂增强免疫反应条带，并捕获膜图像。最后，使用 ImageJ 程序（NIH，Bethesda，MD，USA）对蛋白质表达进行定量。所有实验一式三份进行。

2.8.薏仁提取物中部分主要游离酚类化合物的分析

为比较薏仁乙醇提取物发酵后游离酚类化合物的变化，将NFAB和FAB以相同浓度（50 mg/mL）溶解并应用于高效液相色谱（HPLC）。将没食子酸、对香豆酸、阿魏酸和芥子酸（美国密苏里州圣路易斯）以 5、10、20、50、100 μg/mL 的浓度溶解在甲醇中，制作标准曲线。使用 C18 柱进行高效液相色谱 (HPLC) 分析以测定薏米麸提取物中的一些酚类成分。使用 0.1% 甲酸（溶剂 A）和 100% 乙腈（溶剂 B）的流动相以 1 mL/min 的流速分离样品，并在 280 nm 处检测。梯度系统在 0-5 分钟内为 5% B；5–10% B 在 5–10 分钟内；10-20% B 在 15-20 分钟内；20–30% B 在 20–45 分钟内；30-50% B 在 45-50 分钟内；50–5% B 在 50–55 分钟内；和 5% B 在 55–65 分钟内。在注入 HPLC 仪器之前，使用聚四氟乙烯 (PTFE) 膜 (0.2 μm) 过滤样品。比较标准化合物的 HPLC 保留时间和紫外光谱，用于鉴定提取物中的没食子酸、对香豆酸、阿魏酸和芥子酸。根据标准化合物的曲线计算样品中酚类化合物的浓度。

3 结果

3.1 薏仁提取物对黑色素细胞增殖的影响

在研究薏仁提取物的抗黑色素作用之前，确定了对皮肤细胞安全且无毒的NFAB和FAB浓度。B16F10细胞用不同剂量的薏米提取物处理，通过MTT法检测细胞的活力。NFAB 和 FAB 在高达 100 μg/mL 的剂量下都没有细胞毒性（图 1）。

图 1. 薏仁提取物对黑色素细胞活力的影响。薏仁麸提取物处理后小鼠黑色素瘤细胞的活力。B16F10细胞用0.01～100 μg/mL的NFAB( A )或FAB( B )处理，处理72 h后测定细胞活力。结果表示为三次独立实验的平均值±标准偏差。** p < 0.01, *** p < 0.001 与非治疗组相比。

3.2.薏仁提取物对黑色素含量的影响

通过用样品和 α-MSH 处理 B16F10 细胞 72 小时来研究薏米麸提取物对黑色素生成的抑制作用。在治疗结束时，测定细胞内和细胞外黑色素含量。B16F10 细胞的细胞沉淀和培养基的图像（图 2）表明 NFAB 和 FAB 强烈抑制 B16F10 细胞中 α-MSH 诱导的黑色素积累。图 2 A、B 显示，与 α-MSH 组相比，NFAB 和 FAB 以剂量依赖性方式显著抑制细胞内黑色素和细胞外黑色素含量。当在相同浓度下比较时，FAB 在 12.5 至 50 μg/mL 浓度下对细胞外黑色素和在 12.5 和 50 μg/mL 浓度下对细胞内黑色素显示出比 NFAB 更高的抑制活性。图 2 C、D)。

图 2. 薏仁提取物对 B16F10 细胞黑色素含量的影响。B16F10 细胞用或不用 α-MSH (100 nM) 和薏仁麸提取物 (12.5–100 μg/mL) 或熊果苷 (200 μg/mL) 处理 72 小时。处理后，在 405 nm 处测量细胞内黑色素含量 ( A ) 和细胞外黑色素含量 ( B )。比较了NFAB和FAB在相同浓度下的黑色素含量：细胞内黑色素（C）和细胞外黑色素（D）。结果表示为三次独立实验的平均值±标准偏差。### 与非治疗组相比，p < 0.001；* p < 0.05，** p < 0.01，***p < 0.001, **** p < 0.0001 与相同浓度的 α-MSH 组 ( A , B ) 或 NFAB 组 ( C , D ) 相比。

3.3.薏仁提取物对酪氨酸酶活性的影响

在 α-MSH 刺激的 B16F10 细胞中检测了 NFAB 和 FAB 对细胞酪氨酸酶（参与黑色素合成的主要酶）的影响。在 α-MSH 处理条件下，与未处理组相比，酪氨酸酶活性强烈上调至 160.44%。然而，NFAB和FAB以剂量依赖性方式显著抑制细胞酪氨酸酶活性。NFAB和FAB在比NFAB强100μg/mL的浓度下使细胞酪氨酸酶显著降低了65.94%和78.68%（图3A）。此外，在高于 12.5 μg/mL 的所有浓度下，FAB 比 NFAB 更强的酪氨酸酶活性降低，尤其是在 50 μg/mL (17.34%) 时（图3B）。

图 3. 薏仁提取物对 B16F10 细胞酪氨酸酶活性的影响。B16F10 细胞用或不用 α-MSH (100 nM) 和薏仁麸提取物 (12.5–100 μg/mL) 或熊果苷 (200 μg/mL) 处理 72 小时。处理后，在 475 nm 处测量酪氨酸酶活性 ( A )。比较了 NFAB 和 FAB 在相同浓度下的酪氨酸酶活性 ( B )。结果表示为三次独立实验的平均值±标准偏差。### 与非治疗组相比，p < 0.0001；* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 与 α-MSH 组相比 ( A) 或相同浓度的 NFAB 组 ( B )。

3.4.薏仁提取物对 B16F10 细胞 Mc1r、Mitf、Tyr、Trp-1 和 Trp-2 基因表达的影响

实时 qPCR 用于评估 NFAB 和 FAB 对黑色素生成相关基因（如 Mc1r、Mitf、Tyr、Trp-1 和 Trp-2）表达的影响。由于上述结果表明，与 NFAB 相比，FAB 在 12.5 和 50 μg/mL 的浓度下显著降低细胞内和细胞外黑色素（图 2 C，D），仅在 12.5 和 50 μg 的浓度下检查基因表达/mL 用于 NFAB 和 FAB。

图 4中的结果表明，α-MSH 上调了 Mc1r、Mitf 和 Mitf 下游基因如 Tyr、Trp-1 和 Trp-2 的表达。NFAB和FAB均下调Mitf、Tyr、Trp-1和Trp-2，FAB的作用强于阳性对照熊果苷。此外，FAB 还比 NFAB 更强烈地抑制黑素生成相关基因的水平，在 50 μg/mL 时具有显著影响。此外，只有 FAB 显著抑制 Mc1r 基因水平，而不受 NFAB 影响。

图 4. 薏米麸提取物对 B16F10 细胞中 Mc1r、Mitf、Tyr、Trp-1、Trp-2 mRNA 表达的影响。B16F10 细胞用或不用 α-MSH (100 nM) 和薏仁麸提取物或熊果苷 (200 μg/mL) 处理 2 小时或 24 小时。处理后，测量 Mc1r ( A )、Mitf ( B )、Tyr ( C )、Trp-1 ( D ) 和 Trp-2 ( E ) 的 mRNA 表达并将其标准化为 GAPDH 表达。结果表示为三次独立实验的平均值±标准差#### 与非治疗组相比，p < 0.0001，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p< 0.0001 与相同浓度的 α-MSH 组或 NFAB 组相比。

3.5.薏仁提取物对 B16F10 细胞黑色素酶蛋白表达的影响

Tyr 是一种参与黑色素生成的主要蛋白质。将多巴色素转化为 5,6-二羟基吲哚-2-羧酸的 Trp-1 和氧化 5,6-二羟基吲哚-2-羧酸的 Trp-2 也是与黑素生成相关的非常重要的酶。通过蛋白质印迹评估NFAB和FAB对黑色素相关蛋白Tyr、Trp-1和Trp-2的调节作用（图5）。

图 5. 薏仁提取物对 B16F10 细胞中黑色素蛋白表达的影响。B16F10 细胞在不存在或存在薏仁麸提取物或熊果苷 (200 μg/mL) 的情况下用 α-MSH 处理 48 小时。通过蛋白质印迹法测定蛋白质表达 ( A ) 和酪氨酸酶/β-肌动蛋白 ( B )、酪氨酸酶相关蛋白 Trp-1/β-肌动蛋白 ( C )、Trp-2/β-肌动蛋白 ( D ) 的蛋白质水平通过定量ImageJ 程序。结果表示为三次独立实验的平均值±标准差#### 与非治疗组相比，p < 0.0001，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p< 0.001, **** p < 0.0001 与相同浓度的 α-MSH 或 NFAB 组相比。

当 B16F10 细胞受到 α-MSH 刺激时，Tyr、Trp-1 和 Trp-2 蛋白表达显著增加。然而，NFAB 和 FAB 强烈抑制 B16F10 细胞中 α-MSH 刺激的 Tyr、Trp-1 和 Trp-2 表达。与 NFAB 组相比，FAB 处理还显著降低了 Tyr、Trp-1 和 Trp-2 的蛋白质水平。Tyr 在 50 μg/mL 时降低了约 3 倍。

3.6.薏米麸皮发酵后酚类化合物的变化

将未发酵的薏米麸皮提取物的薏仁乙醇提取物中一些酚类化合物的浓度与用短乳杆菌MJM60390 发酵 48 小时的提取物的浓度进行比较。鉴定出四种活性游离酚类化合物，没食子酸、对香豆酸、阿魏酸和芥子酸（图 6）。与 NFAB 相比，FAB 中所有这四种成分的浓度分别显著增加了 1.71、1.77、1.86 和 1.79 倍（表 2），表明发酵增强了 NFAB 的生物活性化合物。

图 6. 薏米提取物中酚类化合物的 HPLC 分析。色谱图中显示了 200 nm 至 400 nm 的紫外吸收光谱和每种标准化合物的线性。

4 讨论

肤色受内在因素（遗传、皮肤类型和压力）和外在因素（阳光照射和环境污染）的影响[ 3、34、35、36 ]。人的肤色源于皮肤的最外层，黑色素是由黑色素细胞产生的。因暴露于紫外线辐射而产生的皮肤色素沉着可以保护皮肤免受有害的紫外线伤害。然而，黑色素的过度产生会导致审美问题，例如黄褐斑、雀斑色素沉着、雀斑和老年斑[ 3 , 37 ]。黑色素是由黑素细胞在黑素体中合成的。在黑色素生成中，酪氨酸酶负责l-酪氨酸到l -3,4- l -DOPA 和l -DOPA 到多巴醌。多巴醌是真黑素（棕色/黑色素）和褐黑素（红色/黄色素）合成途径中常见的中间体。在真黑素合成过程中，多巴醌转化为多巴色素，并被酪氨酸酶相关蛋白2或多巴色素互变异构酶转化为5,6-二羟基吲哚-2-羧酸（DHICA），最后Trp-1催化DHICA形成真黑素[ 6 , 38]。因此，抑制酪氨酸酶、Trp-1 和 Trp-2 作用的化合物对于调节皮肤色素沉着很重要。此外，过度暴露于 UVB 照射会导致 ROS 的产生增加，从而刺激黑色素细胞产生更多的黑色素[ 12 ]。抗氧化剂可以是 ROS 清除剂。因此，具有高抗氧化活性的化合物也有可能成为抗黑色素剂。

L-抗坏血酸、曲酸、熊果苷、皮质类固醇和对苯二酚等传统药理物质已被用作抗黑色素生成剂，通过有限的酪氨酸酶活性或减少存在的黑色素细胞数量来淡化肤色[ 39 , 40 ]。然而，几乎所有这些药物都有缺点，包括细胞毒性、不稳定性、热敏感性、接触性皮炎、刺激性、高毒性和潜在致癌性[ 41、42、43]。因此，研究机构和化妆品公司进行了研究，以开发更安全的替代美白剂，例如具有高抗氧化活性、价格更低、稳定性和有效性更高的天然化合物或植物提取物。

在这项研究中，我们报道了薏米麸皮提取物可抑制黑色素生成，并具有作为功能性化妆品美白成分的潜在应用。在本研究中，通过 α-MSH 刺激显著增加的黑色素含量和酪氨酸酶被 NFAB 和 FAB 显著抑制（图 2和图 3）。与浓度高于 12.5 μg/mL 的 NFAB 处理相比，FAB 处理中的酪氨酸酶活性显著降低（图 3）。然而，在最高浓度（100 μg/mL）下，FAB 和 NFAB 之间的黑色素浓度没有显著差异，可能是因为在这个剂量下，薏仁处理组的黑色素含量已经低于未处理组并且在 B16F10 细胞中已达到最低黑色素浓度，无法进一步降低（图 2）。

此外，NFAB 没有显示出 Mc1r 和 Mitf 基因水平的差异，而 FAB 抑制 Mc1r 和 Mitf。与 NFAB 相比，FAB 对 Tyr、Trp-1 和 Trp-2 基因的表达也显示出更大的下调作用（图 4）。Tyr、Trp-1 和 Trp-2 的蛋白表达也受到 FAB 更强的抑制，尤其是在 50 μg/mL FAB 时 Tyr 蛋白表达（图 5）。总之，这些观察结果表明，NFAB 和 FAB 的抗黑色素生成作用是由于抑制了酪氨酸酶、Trp-1 和 Trp-2 的基因水平。此外，发酵还通过下调 Tyr、Trp-1 和 Trp-2 的蛋白质表达来增强 FAB 的抗黑色素生成作用。

植物中存在三种类型的酚酸：游离型、可溶性共轭型和不溶性结合型。游离形式的酚类很容易提取，而酚类化合物的共轭形式和结合形式在提取前需要进行碱性水解[ 44 ]。在这项研究中，使用 70% 的乙醇进行提取，因为简单的提取过程对于工业应用非常重要。因此，只能提取游离酚类化合物。HPLC分析表明，发酵后没食子酸、对香豆酸、阿魏酸、芥子酸等游离酚类化合物显著增加（表2）。发酵是一种生化过程，通过微生物产生的酶将共轭形式的酚类化合物转化为游离形式的酚类化合物，从而增加植物材料的营养成分。例如，用真菌米曲霉CCT 4359 [ 45 ] 发酵的全大豆粉中的苷元增加，LAB 发酵的全谷物大麦和燕麦去壳中的游离酚酸增加[ 28 ]，以及苷元、黄烷醇和没食子酸的水平。由短小芽孢杆菌HY1发酵的 cheonggukjang（韩国传统发酵大豆）增加[ 46]。本研究中游离形式的酚类化合物的增加可能是由于在发酵过程中，短乳杆菌MJM60390将共轭或结合形式的酚酸酶水解为游离形式。

在我们的研究中，没食子酸、对香豆酸、阿魏酸和芥子酸等游离酚类化合物在用短乳杆菌MJM60390 发酵后显著增加（表 2）。据报道，这些酚类化合物具有抑制黑色素合成的能力 [ 47 , 48 , 49 , 50 , 51]。因此，发酵对没食子酸、对香豆酸、阿魏酸和芥子酸等酚类化合物的增强可能是导致 LAB 发酵薏米具有更强的抗黑色素生成作用的原因之一。另一方面，我们不能排除一些其他化合物可能有助于增加活性的可能性，因为细菌可以在发酵过程中产生许多次生代谢物。据报道，其中许多次要物质具有生物学功能。在未来的工作中应该做进一步的探索，通过纯化来找出活性化合物。此外，这些已知和未知化合物之间的相互作用对抗黑色素生成活性的影响也不容忽视。

5 结论

总之，我们的研究结果表明，发酵过程提高了薏米麸皮的抗黑色素生成效果。FAB 抑制 B16F10 黑素细胞中的细胞内和细胞外黑色素合成。FAB 下调 Mc1r、Mitf、Tyr、Trp-1 和 Trp-2 基因的 mRNA 表达。FAB强烈抑制酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1和酪氨酸酶相关蛋白2的蛋白质水平。发酵后增加的没食子酸、对香豆酸、阿魏酸和芥子酸等酚类成分可能有助于增强FAB的美白效果。基于这些结果，本研究表明 FAB 比 NFAB 具有更强的抗黑色素生成作用，并具有用于美白化妆品的潜力。

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原文：Nguyen, H.T.; Gu, M.; Choi, C.W.; Choi, Y.-H.; Suh, J.-W.; Cheng, J. Enhanced Anti-Melanogenic Effect of Adlay Bran Fermented with Lactobacillus brevis MJM60390. Appl. Microbiol. 2022, 2, 502–515. https://doi.org/10.3390/ applmicrobiol2030039