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今天推送的文章是2022年7月发表在ACS Catalysis上的“Engineering Embden–Meyerhof–Parnas Glycolysis to Generate Noncanonical Reducing Power”，通讯作者是来自加州大学尔湾分校化学和生物分子工程系的李晗教授。

生物制造应用工程生物系统从可再生资源中合成燃料和特殊化学品。这些过程通常依赖氧化还原辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸[NAD(H)]或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[NADP(H)]。这些天然氧化还原辅因子的大规模使用受到两个限制:(1)它们在无细胞生物制造中使用昂贵；(2)在全细胞生物制造中被大量宿主固有的代谢途径共享，这些代谢途径阻止还原能力直接转移到所需的反应。克服这些挑战的一个有希望的解决方案是利用结构上不同的非经典辅因子，如烟酰胺单核苷酸(NMN⁺)，它保持了天然辅因子的电子传递功能，由于体积更小，成本更低，其提供了更快的传递优势，并有效地支持了电子能量的特异性传递，而天然酶无法利用NMN(H)。

糖酵解途径（EMP）是大多数底盘生物在全细胞生物制造中主要的原料摄取途径。在无细胞生物制造中，EMP途径已在体外被有效重构以降低成本。虽然之前已经在Entner-Doudoroff (ED)途径和戊糖磷酸途径(PPP)中对酶进行设计利用非经典辅因子，但是尚未对EMP途径展开相应研究。本研究设计了变形链球菌非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Sm GapN)以利用NMN⁺。SmGapN将d-甘油醛-3-磷酸(D-G3P)转化为3-磷酸甘油酸(3-PG)而不产生ATP。用SmGapN取代大肠杆菌中固有的磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GapDH)，建立了一种ATP中性的EMP通路，用于无细胞生物制造，绕过了平衡ATP的需要。在体内，该途径比产生ATP的途径在热力学上更有利，因而有可能实现高通量。由于糖酵解通量在很大程度上受细胞内NAD⁺和ATP的可利用性调控，因此，与天然氧化还原辅因子和天然能量流动脱离的EMP途径将成为一个强大的工具，可以独立于细胞的生理状态灵活调节代谢。

在这项工作中，作者的目标首先是利用NMN+构建具有高催化效率和高周转率的SmGapN突变体以应用于无细胞生物制造；其次，在全细胞生物制造中应用，需要一个具有最低NAD(P)⁺依赖活性的正交SmGapN，通过EMP糖酵解以NMNH的形式专门获取电子，将能量引导到所需的下游通路。为了实现这些目标，作者进行了多轮Rosetta建模指导的合理设计，迭代提高SmGapN依赖NMN+的活性，并获得了活性最高的突变体GapN Penta (P179K-F153S-S330R-I234E-G210Q)，与野生型相比，催化效率提高了45倍，周转率提高了68倍。此外，作者设计了GapN Ortho (P179K-F153S-S330R-I234E-G214E)，从天然辅因子NADP+到NMN⁺，具有约3.4 × 10⁶倍的辅因子特异性转换。GapN Ortho对NADP⁺和NAD⁺的活性都大大降低，使得在工程大肠杆菌内建立第一个正交EMP糖酵解，其中糖酵解通量特别依赖于NMN⁺。通过加强与NMN⁺磷酸基的结合相互作用，同时抑制NAD(P)⁺，从而实现工程化NMN⁺特异性酶的合理设计。

然而，正如实验和分子模拟结果所显示的那样，这种策略面临着一个瓶颈，即越来越紧密的 NMN⁺结合干扰催化所需的精确蛋白质构象动力学。因此，这项工作也突出了工程非经典辅因子依赖酶的合理设计和定向进化的互补性，后者需要产生补偿性突变来恢复静态结构模型不明显的蛋白质动力学。这里报道的 NMN⁺依赖性 GapN 偶联生长表型将为实现 NMN⁺依赖性活性的定向进化提供基础。

合理设计 GapN 提高 NMN⁺依赖活性

最初的几轮合理设计是基于构建新的极性互作以提高对 NMN⁺的结合亲和力。作为单核苷酸，NMN⁺缺乏典型的第二个核苷酸，在辅因子被截短的位置暴露出单个带负电荷的磷酸盐（图1A）。GapN 的天然氧化还原辅因子 NADP⁺包含一个磷酸化的单磷酸腺苷 (AMP) 部分，它可以与活性位点残基形成盐桥或氢键，并在结合位点内实现有利的疏水堆积（图1B）。这些关键互作包括从 SER 231的羟基到 AMP 磷酸盐的氢键、与腺苷酰胺形成氢键的 ASP 215，以及在 LYS 177 和 THR 180 处围绕 2'磷酸盐的极性相互作用网络。截短的辅因子 NMN⁺缺少 AMP 部分，无法形成这些相互作用；因此，它显示出降低的亲和力，以至于几乎无法检测到特异性活性。

利用 Rosetta 系统地模拟辅因子结合位点的氨基酸取代对预测的 NMN⁺结合态和亲和力的影响。在模拟过程中，允许设计NMN⁺6 Å 以内的所有侧链，并允许配体8 Å 以内的任何残基的骨架运动。根据蛋白质-配体结合能和系统总能对得到的构象进行排序，并选择得分最高的输出进行进一步的检验和设计。

研究表明，辅因子的烟酰胺和核糖部分在催化过程中必须保持移动状态，并在酰化和氢化物转移步骤中采用不同的结合方式。于是作者首先专注于加强与 NMN⁺中相对静态的磷酸基团的相互作用。因此构建了P179K突变体 (GapN 185)，其比活性增加至 18 ± 2 nmol min^–1mg^–1（图1C），Rosetta 模型表明，赖氨酸与带负电荷的磷酸基团形成盐桥（图1D）。

对于第二轮设计，在 GapN 185 之上引入了单个突变，两个突变体显示的 NMN⁺特异性活性逐渐增强：P179K-F153S (GapN 187) 为19 ± 1 nmol min^–1mg^–1，P179K-S330R (GapN193)为24 ± 0.6 nmol min^–1mg^–1。三点突变体 P179K-F153S-S330R (GapN Triple)显示活性增加至68 ± 6 nmol min^–1mg^–1。建模表明，F153S 和 S330R 都在 NMN⁺的游离磷酸基团尾部形成额外的极性相互作用 (图1D)。

在挖掘完NMN⁺周围的可能突变位点之后，第三轮设计通过减少结合残基的多余构象熵来加强与NMN⁺的相互作用。设计了四点突变体P179K-F153S-S330R-I234E (GapN Quad)，特异性活性为86 nmol min^–1mg^–1(图1C)。I234E与P179K形成盐桥，使其与NMN⁺进一步形成有利的相互作用(图1D)。模型中G210Q通过形成氢键稳定I234E的构象，因此五点突变体P179K-F153S-S330R-I234E-G210Q (GapN Penta)的活性进一步增强，为110±5 nmol min^–1mg^–1(图1D)。

上述结果与 NMN⁺依赖性活性随着酶与 NMN⁺之间相互作用的增加而继续增加的假设一致。然而当引入突变 I326K 与 NMN⁺磷酸盐形成另一个盐桥时，其活性降低(图1C)。动力学分析显示，与GapN Penta 相比，所得到的突变体 GapN Hex (P179K-F153S-S330R-I234E-G210Q-I326K)的K_m降低了2.4倍，而NMN⁺的k_cat 从 GapN Penta 的0.82 ± 0.1 s^-1显著降低到 GapN Hex 的0.12 ± 0.01 s^-1。因此GapN Hex 表现出复杂的上位关系，多位点突变的影响无法在该静态模型中准确预测。在酶骨架结构中也没有显示出大的变化。因此，作者接下来进行了分子动力学模拟以研究催化过程当中所涉及到结构和动态变化。

阐明辅因子结合与周转效率之间的权衡

首先模拟了GapN四聚体每个单体的骨架柔性，与野生型和高周转率突变体 GapN Penta 相比，高 NMN⁺结合亲和力突变体 GapN Hex 变得更加刚性，作者接下来试图探究突变如何导致骨架柔性以及柔性的变化如何影响催化。

Rosetta 模型显示 GapN Hex 中的S330R、I326K 和 P179K 直接与 NMN ⁺分子的磷酸盐相互作用以将其固定在结合口袋中，从而改变了骨架柔性。这三个位点位于结合口袋的开口处，并向蛋白质的不同结构域延伸。因此，当存在 NMN⁺时，不同的域可能会更紧密地联系在一起，从而导致全局构象动力学发生改变。然而，通过这个静态模型，第二个问题仍然无法解决。

周转率与催化残基的预反应状态密切相关。基于野生型 GapN 的催化机制，催化残基 CYS 284 对 G3P 进行亲核攻击以生成半硫缩醛中间体。评估四聚体 GapN 的分子动力学模拟可以揭示远端突变对催化残基构象的影响。通过监测CYS 284 上的硫原子与SER 450 的 α 碳之间的距离，作者观察到野生型、GapN Penta 和 GapN Hex CYS 284的不同状态（图2 )。野生型所有单体表现出对 9-10 Å 距离的偏好（CYS“in”状态），其特征是 CYS 284 被烟酰胺部分的C4定位以进行直接氢离子转移（图 2a）。对于 GapN WT 中的单体A，在 12 Å 处观察到了一个特殊的状态，CYS 284背离活性中心（CYS“out”状态）。在 GapN Penta 中观察到类似的能量分布（图2B ）。SmGapN 在生理上作为四聚体发挥作用，并且发现与其同源的Thermoproteus tenax GapN 表现出不连续的饱和动力学，这意味着亚基之间的协同作用受变构效应的调节。所观察到的不同单体之间CYS交替的“in”与“out”状态表明分子动力学模拟能够捕获这种动态协同性。

与野生型和 GapN Penta 相比，几乎所有 GapN Hex 单体都更偏好 12 Å CYS“out”状态（图 2 C）。催化残基半胱氨酸的构象差异表明GapN Hex中 NMN⁺的k_cat降低是由于半硫缩醛中间体形成中 CYS 284 的不正确构象。此外，没有观察到单体之间的变构协同性，因此需要进一步分析获得柔性变化的机制基础。

作者通过计算四聚体的所有残基对之间的α碳的动态相互关系来分析轨迹，并由此计算出最短路径网络。最短路径算法允许检查变构运动如何在蛋白中传播。野生型的分析揭示了一个广泛的网络，该网络延伸到每个单体中，并且动态通路通过四聚体界面，如图3A所示，球体的大小代表路径使用的频率得分高低。

GapN Penta 表现出动力学整体网络连通性的降低以及从四聚体界面向单体内聚集的转变，导致单体间通路呈减少趋势（图3B）。然而更显著的变化发生在 GapN Hex 中，其中残基、路径和网络范围的数量显著减少，展现出非常有限的动态通路（图 3C）。总体而言，网络分析表明，GapN Hex 可能由于其过于刚性的结构驱动的变构效应而无法定位 CYS284以实现最佳催化构象而致使催化活性的损失。与野生型相比，GapN Penta对NMN⁺的催化效率和转化率分别提高了约45倍和68倍，因此，提高NMN+亲和力的合理设计应该以尽量减少对柔性的破坏为前提。

正交性 GapN 工程

具有高周转数的GapN Penta非常适合无细胞生物制造，通过提供高 NMN⁺浓度和低 NAD(P)⁺可以限制与其他辅因子的串扰。然而在全细胞生物制造应用中，从EMP途径到目标生物转化的特定电子传递是必须的，因此需要在这些天然辅因子的生理水平上具有最小的NAD⁺和NADP⁺活性的GapN突变体。

为了评估GapN突变体的性能，作者将细胞生长速率与 GapN NMN⁺活性耦合，使用细胞生长作为正交性的评估。通过用Sm GapN取代由 gapA 编码的大肠杆菌的天然甘油醛-3-磷酸脱氢酶(磷酸化)来实现该目的。此外，通过敲除由 mgsA 编码的甲基乙二醛合酶，EMP 糖酵解中绕过 GapN 步骤的潜在途径也被破坏(图4A)。然后作者进一步破坏编码 NMN⁺酰胺水解酶的基因 pncC，以减少外源供应的 NMN⁺降解。

尽管在 GapN Penta 中对 NADP⁺的催化活性降低了9300倍，但是在不提供 NMN⁺的情况下，含有 GapN Penta 的细胞仍然显示出显著的生长(图4B)。在作者之前设计 NMN⁺正交葡萄糖脱氢酶的研究中，在 AMP 部分附近引入带负电荷的氨基酸，与 NAD⁺和 NADP⁺的焦磷酸基团产生静电排斥，以破坏其结合，同时避免对 NMN⁺结合的不良影响。根据相同的设计原则，将突变 G214E 引入到活性最高的突变体 GapN Quad 和 GapN Penta 中。由于与现有突变的潜在冲突 ，导致在GapN Penta 中显示出负结果，但它在 GapN Quad 中成功使 GapN Ortho (P179K-F153S-S330R-I234E-G214E)的NADP⁺活性降低21倍，同时保留了对 NMN⁺活性的70% ，G214E 的引入同时也降低了 NAD⁺的特异性活性。

产生的正交性最高的突变体 GapN Ortho 相对于活性最高的突变体 GapN Penta 表现出对 NADP⁺和 NAD⁺的催化效率降低。从催化效率上看，GapN Ortho从NAD⁺和NADP⁺到NMN⁺的辅因子特异性转换效率分别是野生型的67倍和3.4 × 10⁶倍。尤其是该酶对NAD⁺和NADP⁺的K_m远远超出了大肠杆菌中天然辅因子浓度的生理范围，这表明该酶在体内具有潜在的正交性。所设计的突变也影响了3-磷酸甘油醛（D-G3P）的结合，导致D-G3P的表观K_m从GapN WT的0.22±0.04 mM增加到GapN Penta的0.68±0.1 mM以及GapN Ortho的0.72±0.1 mM。

表达 GapN Ortho 的细胞体内生长研究表明，如果没有 NMN⁺补充，细胞生长会受到严重影响，因为E. coli的首选碳源葡萄糖不能被 EMP 途径消耗。当在培养基中补充2mM NMN⁺时，GapN Ortho 能够实现正常的生长，表明 EMP 途径被成功重新连接，并与NMN⁺浓度耦合。相比之下，保留了NAD/P⁺活性的GapN Penta在没有NMN⁺的情况下显示出显著的增长，表明正交性不足。这些结果首次证明了基于正交氧化还原辅因子设计大肠杆菌糖酵解通路的有效性。

正交性机理的阐明

为了了解 GapN Ortho 与其他 GapN 突变体相比显著的辅因子特异性变化，作者进行了 Rosetta 建模以预测 GapN 野生型，GapN Penta 和 GapN Ortho 与 NMN⁺，NAD⁺ 和 NADP⁺的结合构象。当与 NADP⁺结合时，GapN Ortho 中带负电荷的残基 G214E 与 P179K 形成氢键，稳定了P179K以支持与 I234E 形成的氢键相互作用(图5A)。这种新出现的氢键网络改变了在 NADP⁺ 中填充腺嘌呤环所需的疏水表面，并另外引入空间冲突以将 NADP⁺的 AMP 部分推出结合口袋(图5B)。所预测的结合状态与表观动力学参数一致。GapN Ortho 对 NADP⁺的催化效率分别是 GapN Penta 的50倍和 GapN WT 的465,000倍。另一方面，GapN Ortho与NMN⁺的对接结构与 GapN Penta 观察到的结合模式相似(图 S6) ，这与对NMN⁺活性产生的最小干扰一致。

在与GapN Ortho结合的NAD⁺中也发现了类似但不太明显的位移，其中S330R通过与辅因子的腺苷核糖羟基相互作用成为NAD⁺的额外锚定点。这与实验结果一致，即 GapN Ortho 对 NAD⁺的催化效率高于 NADP⁺。未来可能会围绕 S330R 的工程继续改善正交性。

设计酶以利用 NMN⁺等非经典辅因子具有挑战性，本研究中作者首先通过Rosetta利用结合位点的突变对潜在的NMN⁺结合构象进行采样，以提供提高NMN⁺催化效率的设计建议，从而通过较低的实验成本进行预测性设计。对四聚体 GapN 突变体进行分子动力学模拟以确定发现的突变如何有助于调节周转率和 NMN⁺结合亲和力的变构效应。分析表明，动力学的差异归因于骨架柔性的变化、催化残基半胱氨酸的位移扰动和残基网络通路的改变。这些结果为NMN⁺依赖酶的设计提供了一种策略，并建立了具有生物制造潜力的正交EMP通路的初始步骤。

END

整理：董如月

DOI：10.1021/acscatal.2c01837